PCR y tests de antígenos para la detección de SARS-CoV-2: fundamentos

Anteriormente, he hablado sobre el funcionamiento de los tests rápidos para la detección de anticuerpos en sangre (link al artículo) y en esta entrada me centraré en los fundamentos de la técnica PCR para la detección del virus, así como las nuevas aplicaciones de los tests rápidos para detectar la presencia del virus.  

PCR, por sus siglas en inglés, es el acrónimo de reacción en cadena de la polimerasa. Se trata de una técnica bioquímica ampliamente utilizada en Biología Molecular y desarrollada por Kary Mullis. 

Básicamente, la PCR lo que hace es multiplicar (amplificar) fragmentos de una secuencia específica de DNA. Para ello hace falta una muestra de partida para analizar, cebadores (o primers) que se unirán a parte del DNA de la muestra, bases nitrogenadas disueltas en la muestra y la enzima polimerasa (para simplificar, he omitido otros componentes en el proceso). Los cebadores contienen una secuencia corta muy específica que funcionarían como si fueran un trozo de una huella dactilar.

Las bases nitrogenadas del DNA bien pueden ser adenina (A), timina (T), guanina (G) y Citosina (C) y debido a las propiedades químicas de cada una de estas bases, A se une con T, y C con G. A y T forman dos enlaces de hidrógeno, mientras que G y C tres. Este mismo principio es el que provoca el apareamiento o reconocimiento entre la secuencia del cebador y la muestra a estudiar. 

Cuando el cebador reconoce una secuencia complementaria (como cuando las piezas de un puzzle encajan) a la muestra de DNA, la enzima polimerasa iniciará una reacción que consiste en «capturar» las bases que se encuentran en disolución para sintetizar una copia de la secuencia que ha reconocido. Este proceso se repite durante varios ciclos y al final se obtiene una señal luminosa en función de la cantidad de copias que se hayan obtenido, cuantas más copias: más intensa será la señal. 

¿Cómo se emplea la PCR para detectar presencia del nuevo coronavirus?

Es aquí cuando la historia se complica un poco más. Previamente, he hablado de DNA, pero el material genético del virus SARS-CoV-2 es un RNA compuesto por bases de adenina, guanina, citosina y uracilo. Por ello hace falta la presencia de otro actor en el proceso: la transcriptasa inversa. Esta enzima lo que hace es partir del RNA del virus y sintetizar una copia en forma de cDNA (c por copia complementaria), posteriormente, este cDNA será el material de partida para iniciar el proceso anteriormente mencionado. 

Para determinar la presencia del virus, el cebador tiene que diseñarse con una secuencia muy específica y que únicamente se encuentre en este virus en particular y que no se localice en otros coronavirus. Si el material genético del virus es complementario al cebador, la reacción se llevará a cabo y se obtendrán numerosas copias de la secuencia seleccionada, con la consecuente señal luminosa. 

Si la muestra no contiene el material genético del virus, los cebadores no se unirían y por lo tanto, no habría señal. Sin embargo, nada es infalible y se pueden dar casos remotos de uniones inespecíficas con secuencias de virus sumamente parecidos. Esto no significa que la técnica no sea buena, sino que es posible que los cebadores no estén correctamente diseñados o que aún no se haya encontrado una secuencia «infalible». Con el paso del tiempo y gracias a la inversión enorme en investigación, la fiabilidad está cada vez más garantizada y ahora no se emplea un único cebador, sino alrededor de cuatro secuencias únicas para disminuir al máximo las probabilidades de falsos positivos.

Esta técnica puede ser cuantitativa y ser indicadora de la carga viral en la muestra extraída del paciente. La cuantificación se puede realizar determinando cuántos ciclos de copias han hecho falta para empezar a tener una señal luminosa por encima de un umbral de detección. Por otra parte, una de las desventajas de la PCR es que requiere equipamiento muy especializado, así como reactivos que han sufrido escasez, personal técnico cualificado y tiempo de reacción y manipulación. 

 

Tests rápidos de antígenos

Debido a estas desventajas, además del coste que implica, se han ido desarrollando kits de detección rápida del virus. Ha llevado más tiempo conseguir desarrollar estos tests y las primeras versiones tenían poca especificidad y sensibilidad (los polémicos tests que salieron al mercado en marzo) pero actualmente parece ser que la técnica está lo suficientemente madura para empezar a ser empleada en masa. El funcionamiento de los tests de antígenos sigue el mismo principio que desarrollé en un artículo anterior, sólo que en lugar de detectar la presencia del anticuerpo, se pretende detectar la presencia de varias proteínas en la envuelta del virus. Un anticuerpo sintético se uniría a las proteínas virales, migraría por la tira reactiva y sería reconocido por otro anticuerpo que finalmente mostraría una señal coloreada si se observa la presencia del complejo antígeno+anticuerpo. Esta reacción tardaría alrededor de 15-30 minutos y podría realizarse sin necesidad de instalaciones complejas. 

 

Finalmente y a modo resumen, propongo un cuadro para identificar los tipos de tests que se manejan principalmente en la actualidad:

  Detecta virus / infección Detecta inmunidad
Más rápido y económico test rápido de antígenos test rápido de anticuerpos
Más fiable, pero requiere laboratorio PCR Serología cuantitativa

 

4 comments

  1. Hola!
    Primero gracias por poner contenido académico o científico para disposición de publico en general.
    Y segundo quería comentarte que cDNA hace referencia a DNA complementario. Este DNA se caracteriza por no contener intrones, que son secuencias que no se pueden transcribir.
    Espero haberme hecho entender!
    Otra desventaja de la PCR (detecta presencia del virus) para este coronavirus, es el método de muestreo pues es complicado y el porcentaje de error es relativamente alto, lo que puede llevar a falsos negativos.
    Además pueden haber casos de falsos positivos con el PCR, por ejemplo cuando se toma tiempo después de pasada la infección, pueden existir residuos del virus en la faringe o las fosas nasales, lo cual no implica que aun haya infección, pero si puede dar positivo la prueba

    Gracias!

    1. Muchas gracias José. Efectivamente, la c es de complementaria, pero en literatura académica en inglés también se le denomina copy por ser la copia del RNA mediante la transcriptasa inversa (como mencionas, carente de intrones). Quise simplificar al máximo dado que la intención es el público general no especializado y para no alargar demasiado el artículo.
      Sobre el resto de incisos que haces sobre la PCR, también tienes razón y da para un artículo más, sólo que por simplificación y para no abrumar demasiado, lo consideré interesante para una siguiente entrega. Espero disponer de tiempo para incorporarlo en una especie de comparativa con los tests de antígenos.

  2. Hola Angélica,
    Gran artículo. ¿En qué consiste la señal luminosa del PCR? ¿Algún tipo de fluorescencia?
    Muchas gracias

    1. Buen día Jaime: efectivamente, la señal luminosa se debe a fluorescencia. Para simplificar el artículo, no mencioné que se pueden incorporar sondas fluorescentes que inicialmente están cerca de un «apagador». Cuando ocurre la polimerización, esta sonda se degrada y la molécula fluorescente se libera al medio circundante.

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