Enzimología 7: Mecanismos de catálisis enzimática (Parte 2)

MECANISMOS DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA (PARTE 2)

Índice

PROTEASAS
Evolutivamente hablando, se ha solucionado de distintas formas la hidrólisis de los enlaces peptídicos.

Hidrólisis de enlaces amidas, digestión (como liberación de aminoácidos de cualquier fuente) los aminoácidos son los que entran en las células que darán lugar a las proteínas endógenas. Esta digestión se produce fuera, para lo cual, el organismo debe secretar las enzimas encargadas de la hidrólisis. Será la función de un primer grupo de proteasas.

Se degradan las enzimas fuera de la célula para que no se importen proteínas desconocidas que puedan alterar el status quo de la célula. Estas proteasas digestivas que degradan las proteínas exógenas deben tener baja especificidad para poder hidrolizar cualquier enlace peptídico, el centro activo no debe poner muchas restricciones. Una especificidad muy amplia, con un centro activo poco definido y con pocas interacciones, con pocas interacciones, el factor entrópico será muy malo y se fijará poco al centro activo. Factor solvatación, establecimiento de interacciones que estabilicen el ET, etc. Si la Ecat es baja, el organismo debe sintetizar mucha enzima y supone un gasto energético.

La funcionalidad definirá un tipo de mecanismo catalítico.

Desde el momento en que se sintetiza, puede degradar cualquier proteína endógena y no interesa eso, además deben tener mecanismos de seguridad para que no se activen antes de tiempo. Estos mecanismos son varios, simultáneos y solapantes.

Fundamentalmente dos mecanismos de seguridad:

  • Síntesis de la proteasas en forma de precursor (zimógeno) para que luego se convierta en enzima fuera de la célula. No es suficiente sólo esto, además también las mismas células sintetizan:
  • Otras moléculas que son inhibidores específicos, entonces esta célula tiene inhibidores que se unen con mucha afinidad a esta enzima. En la mayor parte de los casos es una proteína. Esta naturaleza del complejo E/I es específica.

Esto no quiere decir que no haya proteasas dentro de la célula. Regulación del nivel de expresión génica, eso requiere que haya una degradación continua.

Se produce la digestión intracelular, que también afecta a todas las proteínas. Las proteasas responsables de esa digestión deben de tener una especificidad baja para poder degradar cualquier tipo de proteína. Regulación, en general en eucariotas hay dos tipos de proteólisis digestivas intracelular que aseguran baja especificidad y las señales que indiquen qué se degrade:

  • Proteasoma: reúne la señal de reconocimiento y degrada. Si el sistema tiene la ubiquitina, entra y se digiere. Las enzimas que forman parte del proteasoma tienen sus centros activos. Al final, la catálisis es lo que pasa en los centros activos y deben ser las enzimas lo más inespecíficas posibles.
  • Lisosomas: orgánulos subcelulares.

PROTEASAS REGULADORAS

No convertir proteínas en aminoácidos, sino de disparar una respuesta. Todas convierten el sustrato en una señal. Mecanismo de regulación por proteólisis limitada. Son muy específicas, un único enlace peptídico en un único sustrato. La ruptura de este único enlace es la señal.

La regulación son procesos de señalización muy particulares, el fenómeno desencadenado es irreversible y es muy drástico, afecta a procesos que provocan grandes cambios, relacionados con adaptaciones de la célula a fenómenos con alta relevancia. Como la apoptosis en las caspasas, es una activación geométrica, morfogénesis de un tejido, coagulación, activación del complemento, etc. Esta actividad proteolítica es muy distinta en regulación.

En todas las proteasas pasa lo mismo exactamente.

Prácticamente todas pueden clasificarlas en cuatro.

Mecanismos distribuidos entre enzimas que en muchos casos tienen relación filogenética y en otros no, muchas proteasas se han inventado de manera independiente varias veces a lo largo de la evolución. La formación de un centro activo que puede hidrolizar enlaces peptídicos. Los cuatro mecanismos de catálisis que explican cómo funcionan todas las enzimas proteolíticas son:

  • Serin-proteasas: todas utilizan un mecanismo idéntico basado en una Ser en el centro activo que usa un mecanismo de catálisis covalente. Y la Ser forma un intermedio covalente en algún momento de la reacción. Son serin-enzimas porque todas tienen la Ser en el centro activo y que en muchos casos no hidroliza enlaces peptídicos, sino otro tipo de reacciones. Todas hacen lo mismo, tienen un contexto muy parecido. Todas las enzimas con Ser en el centro activo trabajan así. Una Ser es un residuo muy malo, -OH es un grupo poco reactivo. Normalmente no participa en un mecanismo de reacción. Lo importante no es la Ser, lo importante es que la Ser está en un contexto estructural muy particular.

Hay una triada catalítica: una Ser y otros dos aminoácidos: Asp, His, Ser. En todas las serin-proteasas hay estos tres en posiciones idénticas. Hacen que esa Ser es particularmente reactiva.

Esto ha aparecido dos veces, todas las estructuras se parecen entre sí de forma que se pueden agrupar en dos familias dentro de las serin-proteasas y tienen un estructura completamente diferente excepto por la triada. Han aparecido en la evolución de forma independiente.

Tripsina, quimotripsina y elastasa.

  • Tiol-proteasas: Cys en el centro activo, por lo demás tiene el mismo contexto pero la Cys es más reactiva que la Ser. Catálisis covalente.
  • Aspartin-proteasas (muy distinto mecanismo). El mecanismo catalítico son los 2 Asp, no hay catálisis covalente. Pepsina
  • Metaloproteasas (también mecanismo totalmente covalente) Zn2+. Un átomo metálico en el centro activo, por eso es un oligoelemento esencial. Procarboxipeptidasas a y b.

La fam de la tripsina es la que más se conoce, es una proteasa digestiva que libera todos los aminoácidos de cualquier proteína del alimento. En el intestino, procarboxipeptidasa a, procarboxipeptidasa b, tripsinógeno, proelastasa, quimotripsina.

Proelastasa, tripsinógeno y quimotripsina son Serin proteasas.

Intestinal: enteroquinasa, el tripsinógeno es su sustrato.

En el intestino se han hidrolizado el 30% de los enlaces, no se puede hidrolizar completamente todos los enlaces por lo que dura la digestión. Lo que se ha liberado en realidad será una mezcla de aminoácidos, dipéptidos y tripéptidos que son absorbidos por la muchosa intestinal. Están llenas de di y tripeptidasas, la hidrólisis se completa dentro de la mucosa intestinal. En la absorción se completa el otros 70% de hidrólisis.

TRIPSINA

Dominada por las láminas β, dos hélices α. La lámina β es peculiar porque hay dos dominios independientes. Relativamente independientes en el plegamiento, cada uno forma un barril β. Lo barriles β están dispuestos perpendicularmente. Entre los dos barriles está el centro activo, es muy frecuente. Se forman en la interfase entre dos dominios e incluso entre dos subunidades diferentes. Son en forma de comecocos. El plegamiento de las proteínas debe ser compacto y esa cavidad es complicado que se forme y debe ser estable. Si una enzima tiene un centro activo amplio, normalmente son dos dominios perfectamente compactos y estables. Entre los dos forman una interfase donde puede haber la unión con el sustrato.

Esta es una endoproteasa ruptura de enlaces peptídicos en el interior de la cadena. Las exoproteasas rompen cerca del N o C-term. Las estructuras de estas dos son completamente diferentes entre ellas. En las endoproteasas es distinto, sólo por un lado debe unirse el sustrato.

La Ser catalítica está en el centro, entre la His y el Asp hay un puente de H y entre la His y la Ser otro puente de H. 195,57,102 (S,H,D) La Ser está en la parte de abajo y la H y D están arriba, los dos dominios deben estar en la posición adecuada. La actividad catalítica no aparece hasta que los dos dominios no estén bien alineados. Es muy frecuente en las enzimas, los centros activos en la interfase entre subunidades, esta zona es flexible.

En gris oscuro, un barril β, en gris claro el otro.

La lámina β casi nunca es secuencial, es muy frecuente y se le llama topología en clave griega. Los dos barriles son idénticos, sugieren un origen evolutivo de duplicación. Es un vestigio de millones de años que codificaban para una de las mitades, puede indicar que una proteína más primitiva fuera la mitad. Puede que antes la proteína funcionara por dimerización tras el plegamiento y la duplicación génica generara una estructura más favorable. Luego que a base de acumular cambios, ahora ya no es tal cual una duplicación, sino que sean cambios conservativos desde el punto de vista de la estructura. Es una pseudosimetría. Lo importante es la estructura 3D y no la secuencia de aminoácidos.

Hay algunas enzimas que mantienen una estructura que requieren la dimerización de organismos muy particulares. Existen organismos actuales que presentan esta forma de dimerización, para en virus. Son estructuras que se parecen aún a cómo sería la proteasa ancestral porque eso implica duplicar esa parte del gen. Una de estas proteasas es importante es la del virus del SIDA. Los retrovirus tienen pocas enzimas, pero una de ellas es una proteasa, y la de los retrovirus (no es una Ser-proteasa) es una aspartín proteasa homóloga a la pepsina.

Las proteínas más primitivas serías muy pequeñas y a base de duplicar los dominios sencillos y hacerlos más complejos nos lleva hasta las proteínas actuales por evolución. Suma de dominios distintos (o módulos) en los que cada uno de los cuales aporta algo, uno que sea catalítico y los otros dominios que la regulen o la hagan más específica. Para un mismo sustrato pueden llevarse a cabo distintas subunidades.

Zimógeno de la familia de la quimotripsina.

Quimotripsinógeno y quimotripsina (activado por la tripsina)

La activación da lugar a la forma activa.

En la tripsina, los péptidos 147-148 y 14-15 no existen en la forma madura.

De estos cuatro enlaces que se cortan uno es responsable de la activación.

El aminoácido que une el 15 con el 16, basta que con este se corte para que se active, pero los otros también se cortan. Sólo basta con que este enlace se corte. Aunque esté cortado, lo mantiene unido covalentemente por puentes S-S.

Quimotripsinógeno, tripsinógeno y proelastasa son iguales. Por hidrólisis en el aminoácido 15 con el 16. El aminoácido 16 es el Ile (hidrofóbico).

Las diferencias se encuentran en la zona de arriba del zimógeno. Se cortan unos lazos periféricos.

La Ile es un aminoácido hidrofóbico, esa carga + aparece al corte y la aparición del N-term. Ese extremo a pH fisiológico se protona y da una carga + que a su lado hay una carga – donde está un Asp 194. En el que en el zimógeno está desplazado. Cuando se corta, el Asp se desplaza porque la carga negativa polar debe estabilizarse, Cuando no está la Ile, se estabiliza en la región polar. Pero cuando se corta, atrae la carga+ a la del Asp 194. Esto es lo que produce la activación porque este Asp está junto al aminoácido 195 de la Ser catalítica que la arrastra a la posición crítica con los otros dos residuos de la actividad catalítica. Se termina de formar la triada por ese corte, el corte es esencial para esto. Si se sitúa a un pH por encima del pKa se pierde la carga positiva y el Asp vuelve a la posición original y da la inactivación. A pH alcalino se da una reversión y es un efecto conformacional.

La Ile debe estar protonado para que los grupos de la actividad catalítica estén en posición adecuada.

Inhibidores específicos

El otro mecanismo de seguridad.

Inhibidor de tripsina pancreático (en rojo) es una proteína más pequeña. Está metida en la hendidura del centro activo, lo importante es ver por qué está en el centro activo sin que se produzca la hidrólisis del inhibidor. Es diferencia entre lo que hace el inhibidor y el sustrato en el mismo sitio.

Esto sugiere que las serinproteasas aparecen dos veces en la evolución.

Esta tabla muestra los porcentajes de similitud entre los aminoácidos. Se comparan por alineamiento, puede haber desplazamientos y se hace con todas las posibilidades de alineamiento y nos quedamos con la que dé el máximo de similitud.

Con un 60% de similitud puede dar lugar a estructuras parecidas, el plegamiento. Eso se hace comparando estructuras 3D (que están en la parte inferior de la diagonal). Se determinan coordenadas para los átomos y se representan las dos estructuras en el mismo eje de coordenadas hasta encontrar en qué posición relativa las cadenas peptídicas quedan lo más paralela posible. El número entre paréntesis es la distancia en angstrons de distancia promedio.

Cuando se pasa de poca similitud en aminoácidos pero sí en 3D, quiere decir que muchos de esos cambios se han permitido mientras que las estructura 3D se ha permitido, pueden ser posiciones externas que la cadena puede que sea distinta, son cambios conservativos.

Si se comparan las de eucariotas y procariotas dan todas similitudes por encima del 60% en la estructura 3D, determinó que la secuencia podrá ser diferente, pero son todas versiones de la misma proteína. Si se compara la posición de los aminoácidos de los barriles β, la similitud sube por encima del 95% estos dos barriles β son los que se encargan de la estructura del centro activo. Los puntos de activación están en los lazos externos, es un mecanismo para eucariotas. Es por eso que se ha tendido más a la modificación de los lazos externos. Esto da lugar a la evolución de la proteína hasta que se analizó la diferencia interespecífica entre serin-proteasas.

La subtilisina es otra serin-proteasa en la que la similitud es 0 en secuencia de aminoácidos. No se detectaba similitud alguna ni por alineamiento.

Cuando se determinó a la estructura 3D se llegó a ver que no tiene nada que ver con la tripsina ni con la elastasa. Tiene mucha más estructura α, hay una lámina β paralela (en la misma dirección (contrario a los barriles). Cuando una lámina β está orientada en la misma dirección, la cadena debe estar cruzando de un lado a otro la lámina y cuando eso pasa, suele dar lugar a una hélice α. Aunque el soporte estructural no tenga nada que ver, se ha dado la casualidad de la triada que ha aparecido en posiciones equivalentes. Por casualidad estas tienen la misma actividad de serin-proteasa.

La subtilisina y la tripsina son un ejemplo de la evolución convergente.

Proinsulina a insulina, es una conversión proteolítica que es por eliminación del péptido C que da las dos subunidades unidas por un puente s-s y su módulo catalítico es igual al de la subtilisina. La subtilisina es la que más dinero genera y la industria biotecnológica tiene uno de los productos de mayor rendimiento económico que da productos que todos usamos de forma exhaustiva (detergentes). Se usa a Bacillus porque es una enzima que lo lleva al medio extracelular. Es una enzima de amplio espectro, hidroliza con alta especificidad en condiciones muy amplias de temperatura, pH, etc. Se ha ido modificando genéticamente para hacerla más estable, más temperatura, etc. En realidad, la proteasa que hidroliza la proinsulina tiene ese dominio como una sola parte de la estructura, todo lo demás es una estructura aporta propiedades adicionales a la actividad catalítica. En el caso de la proteasa que da la insulina, es la parte que reconoce el sustrato y la enzima se abre y el centro activo se hace accesible y aporta dominios que contribuyen a la regulación para que aparezcan cuando es necesario, las propiedades control se aportan por dominios extras. La parte fundamental, el catalítico es conservado. Luego está la complejidad del contexto de cada una de las proteasas.

Bases moleculares de la especificidad de la familia de la subtilisina.

En la digestión hay al menos tres serín-proteasas distintas con distintas especificidades. La actividad catalítica va por un lado y la especificidad por otro. Se puede alterar un aspecto, sin modificar el otro.

En enzimas que usan macromoléculas como sustrato, la especificidad es algo complicado.

En qué cosas discrimina la enzima cuando cataliza una determinada reacción, el sustrato cuando es una macromolécula, los requerimientos pueden ser múltiples. Es la caracterización de una enzima en particular y se hace de forma sistemática. Las endoproteasas (subtilisina), entra dentro del sustrato y coloca una parte de la estructura del sustrato a los dos lados de la enzima. Se recurre a una determinada nomenclatura.

El sustrato tiene que estar una parte en el centro activo, puede ser un péptido pequeño o muy grande, al aminoácido de sustrato que aporta el grupo carbonilo se llama residuo P1 (la situación P1 del sustrato) y P1’ es la posición que aporta el grupo amino. A partir de ahí se pueden nombrar las otras posiciones: P2, P3, P4, P2’, P3’, etc. La especificidad viene determinada por el reconocimiento de estas regiones por el complejo ES el enlace peptídico quedará en la Ser catalítica, en el centro activo. Cuando se forma el complejo, hay interacciones entre sustrato y enzima (factor entrópico, catálisis por aproximación). Igual que hay un aminoácido P1 y un P1’, se puede definir un sitio S1 y S1’ que son los sitios con los que establecen interacciones con el sustrato a esos niveles.

Sitios P1-S1, P1’-S1’, etc. se llama s por “sitio para aminoácido P1” P1, P2, P3 son aminoácidos concretos del sustrato, pero S1, S2 y S3 son sitios 3D que será un hueco del centro activo que tendrá que ver con el aminoácido, que pueden estar formados por aminoácidos que estén lejos en secuencia. Son SITIOS TOPOLÓGICOS en el centro activo. La especificidad viene determinada por la complementariedad con el sustrato y el centro activo, con las interacciones adecuadas en tamaño y tipo de interacciones, esto se fija y la Ser puede iniciar la reacción.

La definición de la especificidad viene determinada por requerimientos de aminoácidos concretos en cada una de las posiciones que ocupa el sustrato que serán requerimientos establecidos por las interacciones ES.

Dos niveles de especificidad (diferenciación operativa):

  • Especificidad primaria: todos aquellos requerimientos si no están, no hay catálisis. O el sustrato es de una determinada manera, cómo se estricta sea la enzima, si esas condicionantes no se dan, no hay catálisis. TODO O NADA.
  • Especificidad secundaria: siempre que se dan los requerimientos primarios, la reacción puede ser mejor o peor en función de los requerimientos de la especificidad CUANTITATIVA, en función de la Km o Kcat más altas.

Cuando se analizan con detalle los aminoácidos que deben estar para producir la reacción, se encuentran cosas interesantes:

  • ¿Cómo puedo saber qué aminoácidos debe haber en posiciones P1 y P1’? Se puede investigar analizando los extremos amino y carboxilo terminales.
  • Para analizar los requerimientos en las otras posiciones ya no es tan fácil. Es usando unos péptidos sintéticos con secuencias que pueda ir variando de forma que sabiendo P1 y P1’ requeridos, se puede obtener la posición de los aminoácidos en P2, P3 de forma sistemática.

En todas estas serín-proteasas hay cosas comunes a ellas.

En todas sólo hay un requerimiento de especificidad primaria, sólo una posición del sustrato que debe estar ocupada por el aminoácido adecuado y esa posición es la P1. O en la posición P1 está el aminoácido adecuado, o no se produce la catálisis, no quiere decir que en todas las serín-proteasas sea igual, pero la posición P1 debe estar ocupada por el aminoácido adecuado. Y nada más. Da igual lo que haya alrededor. Cuando se analiza si produciéndose la catálisis difiere la eficacia, lo que difiere afecta pero en términos de los aminoácidos que ocupan las posiciones P2, P3 y P4, no afectan P2’, P3’ ni P4’. Eso quiere decir que lo más importante es el sitio S1 cuando se forma el complejo ES y es lo que da la especificidad primaria porque la reacción se produce en ese carbonilo, la Ser catalítica es la que protagonizará la reacción ataca al C carbonílico y debe estar en la posición adecuada y el posicionamiento es de lo que se encargan estas interacciones por eso la P1, interacciones que se adaptan al sitio S1 o no hay catálisis. El carbonilo define este lado donde se produce la interacción y por el otro también hay interacciones y por eso hay efectos cuantitativos, pero del otro lado (P2’, P3’ y P4’) no. Si no se ve nada, estos aminoácidos prácticamente no interaccionan, si interaccionaran deberían de ser de alguna manera, lo mismo da un aminoácido grande que pequeño, probablemente ahí y da igual. Y no se establecen interacciones y probablemente de este lado, el centro activo es amplio, no interacciona. Esto tiene consecuencias, porque cuando se rompe el enlace, una vez separada, se irá del centro activo y la otra parte se queda un tiempo. Pero si la parte del amino se va, la reacción nunca podría revertir. Como consecuencia de que hay una diferencia enorme en fijación, interacciones por este lado o por el otro el que tiene el amino libre gana en entropía y sale del centro activo y la catálisis no puede ir atrás. Estas enzimas catalizan por eso reacciones prácticamente irreversibles.

A nivel de P1.

INHIBIDORES

¿Qué pasa con los inhibidores? el más importante es el inhibidor de la tripsina. El páncreas sintetiza un inhibidor de la tripsina que se une como complejo y esa proteína se une y no se cataliza. Cuando se analiza el complejo ES, el inhibidor en la posición P1 tiene una Lys y la especificidad primaria de la tripsina es una Lys o una Arg, sólo hidroliza enlaces donde haya Lys o Arg en el carbonílico. La especificidad primaria, siempre que está se da la catálisis, entra dentro de los requerimientos de la especificidad primaria.

Cuando se analiza la secuencia de aminoácidos de los inhibidores o los sustratos, todos los inhibidores de la tripsina tienen Lys o Arg, igual que todos los sustratos (aminoácidos básicos), si no lo hay, no se lleva a cabo la catálisis. Las diferencias en secuencia, es en la parte secundaria, son cuantitativa. En los inhibidores en esas tres posiciones aparecen secuencias distintas ricas en aminoácidos Gly, Pro, Ala, Cys, Ser, Thr aminoácidos pequeños. La Gly hidrófobo, Pro es el único cíclico. En los sustratos no se aprecia una tendencia definida, eso parece indicar que si el inhibidor no da lugar a la catálisis es porque en ese lado (secundaria) esa particular composición permite adoptar una conformación especial. El colágeno es la estructura más estable porque 1/3 son Gly y el otro tercio es la Pro que da una rigidez, la Gly evita impedimentos estéricos. La secuencia de los inhibidores en esta parte rica en los aminoácidos como los del colágeno, adopta una conformación igual que a la del colágeno, si en el colágeno se estabiliza la estructura por interacciones entre las hélices y en el inhibidor se establecen las interacciones con la enzima. La cadena va tan paralela que se trenza con la enzima. Esto explica por qué es de alta afinidad la unión, debe tener la enzima más afinidad por el inhibidor que por eso sustrato, esto se produce por una gran complementariedad de la enzima con el inhibidor por los puentes de H.

El inhibidor se acopla perfectamente en las posiciones P2, P3, P4. Esos puentes de H como las interacciones de la triple hélice del colágeno, el ajuste es tan estrecho que no deja sitio ni para las moléculas de H2O, el agua se desaloja totalmente, el agua es un reactante. Empieza la reacción pero queda agotara porque el agua no puede intervenir y es necesario para que se dé la reacción. El ajuste es perfecto, entre inhibidor y enzima. Una desolvatación completa.

En el caso de un sustrato, el centro activo es el mismo, pero aunque la posición P1 se une, la estructura se acopla menos y la desolvatación no es completa. Cuando aparecen casos en los que hay mutaciones genéticas en las que se altera la secuencia de aminoácidos del inhibidor, el inhibidor se sigue sintetizando con menor afinidad y no funciona. Son mutaciones letales, los pacientes autodigieren el páncreas.

ESPECIFICIDAD PRIMARIA

Lo define el sitio S1 y este sitio lo que entra en esta zona está la cadena lateral de una Lys (o una Arg) una cadena alifática larga con una carga positiva, se tiene que acoplar en un bolsillo que se conoce como bolsillo hidrofóbico porque las paredes están formados por aminoácidos hidrofóbicos y la cadena lateral de la Lys es en parte hidrofóbico, el Asp189 a pH fisiológico tiene una carga negativa. La Lys o Arg se complementan perfectamente (tamaño, forma, interacciones) con el bolsillo hidrofóbico que constituye el sitio S1 en la tripsina. Formando interacciones electrostáticas que posiciona a la entrada en el bolsillo al C carbonílico con respecto a la Ser y hace que la tripsina tenga especificidad primaria por la Lys o la Arg.

En la quimotripsina que es una enzima de la familia de tripsina, tiene una especificidad primaria P1 por aminoácidos hidrofóbicos relativamente grandes, aromáticos. Es prácticamente en estructura a la tripsina, con una diferencia en que el aminoácido 189 es una Ser en lugar de un Asp. El bolsillo es igual de hidrofóbico, pero el aminoácido que se puede acoplar mejor es un aminoácido hidrofóbico estrictamente porque ya no hay una carga negativa con el Asp, cuanto más grande, mejor porque rellena mejor el bolsillo porque hay más interacciones.

La elastasa tiene otra especificidad primaria diferente. En P1 es por aminoácidos pequeños: Ser, Ala, Gly todo idéntico a la tripsina, incluyendo el bolsillo hidrofóbico, pero aquí hay dos aminoácidos que en tripsina y quimotripsina es Gly (sin cadena lateral) y aquí en la elastasa uno es Val216 y 190 (aminoácido hidrofóbico ramificado) y el otro Thr226 (aminoácido más pequeño con cadena lateral ramificada con un -OH) son aminoácidos hidrofóbicos que cierran el bolsillo. Y entonces entra con un aminoácido pequeño porque es lo único que puede acoplarse del sustrato (cabe al ser pequeño) para que el C carbonílico contacte con la Ser catalítica.

La misma estructura responsable del mismo mecanismo catalítico cataliza la misma reacción con diferencia muy sutil en especificidad que se deben a cambios puntuales (mutaciones) que no afectan al resto de la catálisis, en este caso al bolsillo hidrofóbico.

Entonces se puede manipular la especificidad de una enzima, sabiendo que hay que modelar las interacciones del bolsillo hidrofóbico y sabiendo qué aminoácidos están ahí, se pueden mutar para ver la complementariedad que interesa.

Se hizo un experimento de mutagénesis muy interesante a partir de esto.

El mutante de tripsina D189K (Asp sustituido por una Lys) la especificidad primaria sería esperada una invertida, ahora sería muy afín por un Asp. Eso en teoría, pero se encontró una especificidad primaria por aminoácidos hidrofóbicos no demasiado grandes y la razón no se pudo conocer hasta determinar la estructura 3D. Cuando se analiza la estructura, el mutante no tiene la Lys donde se esperaba, sino en otro lado porque el bolsillo es hidrofóbico y la carga positiva no puede estar en un entorno hidrofóbico donde no se puede estabilizar, en la tripsina la carga negativa no está en la parte hidrofóbica, sino en el centro, pero la cadena lateral de la Lys es más flexible y queda fuera y queda un bolsillo hidrofóbico estricto con un fondo menos profundo.

En P1 siempre hay Lys o Arg.

No se hidrolizan por el tipo de aminoácidos. P2, P3 y P4 da una conformación muy peculiar en los inhibidores con las enzimas.

La hidrólisis no continúa porque se bloquea el paso del agua, se bloquea la acción enzimática.

El acodamiento se permite gracias a las Pro, la enzima hidroliza los enlaces peptídicos en la superficie del sustrato. Es donde están todos los lazos.

Hueco del bolsillo hidrofóbico de la quimotripsina (Ser189):

Se ha mutado 216 y 226 en tripsina y quimotripsina son Gly y en la elastasa Val y Thr.

G216A Será suficiente para que pase lo mismo por la falta de un protón sin cambiar tanto la estereoisomería. Se han determinado los parámetros para cada forma de la proteína con dos sustratos diferentes. Uno con Arg y Lys. Sustratos adecuados en especificidad primaria, y en términos relativos.

La tripsina wt para Arg la Kcat, Km y kcat/Km son 1 (por relativización). Los mutantes tanto el doble como los individuales producen un efecto malo para la catálisis. La catálisis va 100 o mil veces peor por el simple cambio de un H por un metilo, ilustra hasta qué punto está ajustada la forma con la cadena lateral de los aminoácidos que deben entrar. Un protón por un metilo representa un impedimento estérico.

WT: Arg y Lys se pueden catalizar, pero no igual. Para Lys la kcat=0.9 y la Km es 10, la eficacia catalítica es 0.1 (diez veces peor para Lys que para Arg). En términos cuantitativos también hay diferencia. Cuanto más se rellene, mejor.

Se invierte la preferencia por un metilo en la posición 226 y en la posición 216. En el mutante G226A hay más preferencia por Lys que por Arg. La Arg es un sustrato más grande. Cuando se sustituye, se cierra el bolsillo hidrofóbico. La interacción electrostática es a través de una molécula de agua con la Lys, como la molécula de agua se polariza, hace de puente. Si aparece un metilo, ya no dejaría sitio para la molécula de agua y es hidrofóbico y entonces esta molécula de gua no estaría ahí, entonces la interacción con la Lys está desfavorecida sin esta molécula, establece una interacción electrostática mucho más débil.

Dentro de la familia de la tripsina, hay enzimas con especificidades más complejas. Una enzima con una especificidad muy estricta no puede estar basada sólo en P1 porque no puede discriminar lo suficiente.

TROMBINA

Estructura análoga a la de la tripsina con los dos barriles β y catálisis serin-proteasa. La hidrólisis del fibrinógeno por la trombina es por una cascada. Estos fenómenos de proteolisis son fenómenos en cascada.

En el fibrinógeno a nivel de P1 hay una Lys (frecuente en serin-proteasas) porque hay un aminoácido ácido. No es suficiente con eso sólo, en la posición S6 debe haber en la secuencia del sustrato es un aminoácido ácido porque en el centro activo hay un aminoácido básico. Hay otra región fuera del centro activo 8exositio) debe reconocerse una secuencia que si no se reconoce, no hay catálisis, el conjunto de estas interacciones solamente las puede cumplir el sustrato (fibrinógeno) y lo que pasa en este centro activo es idéntico a lo que pasa con la tripsina. Desde un punto de vista en el contexto biológico, requiere una complejidad mayor de la estructura que está fuera del centro activo.

MECANISMOS DE CATÁLISIS

Las serin-proteasas no sólo hidrolizan enlaces peptídicos, sino que también la tripsina puede hidrolizar enlaces tipo éster. El paranitrofenol hidrolizado es cromogénico y se puede ver a medida que se da la hidrólisis. Quiere decir que el mecanismo de catálisis debe explicar también esta ruptura y no sólo los enlaces peptídicos.

Cuando se medía la liberación de paranitrofenol con el tiempo, la principio se liberaba muchísimo y muy rápido y dependía de la concentración de enzima. Se puede extrapolar a tiempo 0 la parte lenta de la cinética y a partir de este valor de Abs se puede determina la concentración de pNp en etapa rápida y esta concentración es equivalente a la concentración de E. Es una CINÉTICA DE TIPO BURST.

Cada molécula de enzima cuando se pone a la tarea, empieza a catalizar la primera molécula la cataliza muy rápido y las siguientes más lentas.

Se ha analizado la actividad frente a pH usando el mismo sustrato. Con la enzima se pone el sustrato, y en un momento determinado se echa al tubo de ensayo ácido para bajar el pH a 5 (debajo del pKa) para inactivar la enzima y por tanto, se inactiva y la cantidad de pNp no aumenta más. En este momento, se ve que la enzima está modificada químicamente, la enzima tiene mayor masa molecular, esta mayor masa molecular es exactamente CH3-CO, unión covalente del grupo acilo. Ese grupo se une a la Ser 295. Eso quiere decir que si se baja el pH de repente, se “pilla a la enzima in fraganti” da un intermedio acil-enzima.

El acilo está transitoriamente unido covalmentemente a la enzima, es lo típico de una catálisis covalente, para formar la acil-enzima ha liberado la otra parte que es la que ha salido del centro activo. la ruptura del acil-enzima es más lenta que la ruptura inicial del acilo y del pNp. La liberación de la primera molécula del pNp es más rápido, para liberar la segunda molécula tarda más porque llega entonces la interacción con el agua.

La etapa limitante es la de desacilación.

Esto con un sustrato tipo amida. Para que haya sólo una fase en la amida, la etapa de acilación aquí es la etapa limitante.

Cuando se le administran sustratos tipo éster, la etapa limitante es k3. Y aparece una etapa bifásica. La existencia de estas dos etapas y dos constantes k2 y k3 es que sea bifásica y cuando se para la reacción, se ve que está modificada covalentenemente. La acil-enzima es la que lentamente termina la reacción, casi toda la enzima está en forma de acil-enzima. Debe darse que la segunda etapa es la más lenta. En el caso de las amidas, la acil-enzima no se acumula porque la primera etapa es la que es más lenta y el intermedio inmediatamente anterior es el complejo de Mikaelis y la enzima no está modificada en este momento. Esto es un mecanismo típico de catálisis covalente.

Si se compara la reacción catalizada con Ser, no se ve diferencia. Es tan lenta si hay Ser como si no la hay. Varios órdenes de magnitud que si no hay proteasa. Los alcoholes son menos reactivos que el H2O, la Ser per se no aporta nada en la reacción, si aporta, es en el contexto de la triada catalítica. El complejo ES aporta unas contribuciones.

  • Interacciones entre P1-S1 (bolsillo hidrofóbico) aunque la Ser sea poco reactiva, ayuda a la reacción. El enlace que va a ser atacado por la Ser tiene su aminoácido metido en el bolsillo hidrofóbico que es muy estrecho y fijará su cadena lateral en ese aminoácido. Estas interacciones fijan la posición de ese aminoácido para que en la entrada en el bolsillo esté al lado justo de la Ser. Estas interacciones introducen un factor entrópico. Porque fijan en distancia y orientación la posición de los dos grupos que van a reaccionar: enlace peptídico con carbonilo y la Ser por el otro lado, que aunque sea poco reactiva, es mayor cuando está en su contexto enzimático.
  • Interacciones (menos importantes) con las otras posiciones cerca del bolsillo hidrofóbico en el lado carbonilo: P2-P5, S2-S5. Cuantitativamente no da igual. Porque también aporta interacciones al factor entrópico. Siempre por el lado carbonilo, por el amino no hay interacciones.
  • AGUJERO DEL OXIANIÓN: Contribución de la catálisis por distorsión.
  • TRIADA CATALÍTICA:

Agujero del oxianión: Cuando se forma el complejo ES la fijación de la posición en el bolsillo hidrofóbico hace que cuando se una al centro activo, queda justo al lado de la Ser. Cuando empieza la reacción, la triada catalítica empuja la reacción del –OH de la Ser. Este –OH se hace muy reactivo, el O ataca al C carbonílico y se forma el estado de transición. La Ser deja transitoriamente el H+ y se une covalentementemente y se forma el ET (edo de transición). Este O en este estado, tiene una carga negativa que eran los que antes formaban el doble enlace. Esto es el oxianión. EL agujero es el sitio donde se alojará este oxianión en el centro activo.

Cuando se forma el complejo ES que sólo se forma de la manera adecuada cuando entra en el sitio correspondiente, en posición al lado de la Ser correspondiente y eso produce la formación de dos puentes de H entre el O del oxianión y dos NH: con la Ser 195 y el aminoácido 192. Estos dos puentes de H son importantes para la colocación en distancia y colocación de la Ser y el C carbonílico del enlace peptídico. Estos dos puentes de H que constituyen el agujero del oxianión son más importantes.

La estructura del sustrato y del ET son diferentes. El C es uno plano, el otro es tetraédrico. Después del ataque, los puentes siguen formados, sino que también son mucho más fuertes que en el estado anterior, son más cortos y energéticos en el ET que en el sustrato, Porque el O ha cambiado de posición y el sitio del agujero del oxianión está detrás y no en el plano porque la forma del estado del centro activo es tetraédrica para optimizar sobre todo con el ET que es tetraédrico y la geometría es mucho mejor y las interacciones son óptimas. Los dos puentes de H de este agujero están sustanciando la estabilización selectiva del ET. Son más fuertes y tienen más energía del estado de estabilización que cuando tienen la estructura original. Cómo una enzima explota las diferencias estructurales entre sustrato y ET.

Esta estructura tetraédrica se forma cuando se forma el ET y es después de iniciada la reacción. SI los puentes de H son más fuertes cuando el O está detrás, incluso antes del ataque, los H están tirando del O hacia atrás y están deformando el C. El C que antes de unirse es plano, y por tanto ese C ya es un C que no es tan plano y está algo deformado. Y entonces se están llevando ese exceso de caga negativa hacia atrás y al electrofilia está hacia adelante en la deformación y es justo donde está la Ser que entra desde delante. Cuando entra el sustrato y se forman los dos puentes de H que sólo se pueden formar cuando se ha encajado bien en el bolsillo, estos puentes ya están contribuyendo para ir deformando y favoreciendo la reacción para hacer la actividad del O de la Ser vaya directo al C. Todo es posible gracias a todas las interacciones que se produjeron antes. Desde este punto de vista, es una catálisis por distorsión para que se parezca al ET. La forma no plana con el C es inestable y en este caso es la fetén. El agujero del oxianión aporta una contribución de catálisis por distorsión.

Covalente: por la Ser.

Aproximación: bolsillo hidrofóbico.

Mutando la Ser, la enzima pierde la actividad, pero si se compara con la velocidad de reacción no catalizada con E, sigue siendo mucho más rápida porque se sigue favoreciendo por distorsión y aproximación y el H2O por sí sola podrá ser reactante. La reacción en presencia de Serin proteasas sin serinas también puede ser catalizada, a lo mejor 100 veces más que la reacción sin enzima (no catalizada). La contribución por distorsión y aproximación aportan unos dos órdenes de reacción.

TRIADA CATALÍTICA

Suma dos contribuciones distintas.

  • Existencia de la triada en el incremento de reactividad de la Ser. En la triada es mucho más reactiva que el H2O aunque sola, es mucho menos que el H2
  • Participa en la transferencia de protones. También hay mecanismo de catálisis ácido-base. Ahora se tienen las cuatro contribuciones.

Este protón es el del OH de la Ser. Mientras se forma el estado de transición. Hasta que el protó se lo lleva el grupo saliente, pasa unas fracciones de tiempo. SI el protón se va, la reacción se queda retenida porque el grupo saliente debe cogerlo y para eso debe mantenerse cerca para que se lo lleve X. Lo que lo retenga, será la enzima colocando un grupo que actúe como base, un grupo susceptible a protonarse. Pero un grupo que se protone y que tenga ese protón junto al X sustituyente. Asp e His son los dos grupos que son capaces de captar los protones y cederlos en función de su estado de protonación original.

Hay que ver el papel ácido-base y el activador de la Ser.

El Asp102 de la tripsina está justo al lado de la cadena lateral de la His57 y el otro N de la His está formando un puente de H con la cadena lateral de la Ser 195. Las cadenas laterales de los tres aminoácidos están alineadas de manera que se pueden formar estos dos puentes de H. Para eso, en la estructura 3D deben estar cerca. Si falta cualquiera de estos aminoácidos o de estos dos puentes de H, la enzima no funciona. Estos dos puentes de H explican la actividad de la tripsina.

EL sustrato entra, la R se inmoviliza en una distancia que permita que el C carbonílico esté al lado de la Ser. Cuando entra el sustrato, el centro activo es hidrofóbico y cuando entra, la hendidura se desolvata y se hace más hidrofóbico. Este Asp en pH fisiológico está en carga negativa, pero en ambiente hidrofóbico, es más inestable, al entrar el sustrato, es más inestable aún. Para estabilizarse, pierde la carga negativa protonándose cogiendo el H de la His. La His ahora tira del protón de la Ser, donde antes había un alcohol, ahora hay un radical alcóhóxido que es muchísimo más reactivo. La triada catalítica es un Relé de carga, la carga negativa del Asp se traspasa hasta el O de la Ser. El O se hace especialmente reactivo y el ataque se produce.

Es imposible que se forme un radical alcóxido porque el hidroxilo de un grupo alcohol es muy difícil ionizarse hasta ese punto. El pKa es del orden del 15 para que el protón se pierda, es imposible.

No es necesario arrancar completamente el protón a Ser para que se produzca la reacción. Entra el sustrato, se da la desolvatación, altera al Asp que se protona y se inicia la captación del protón. Iniciar quiere decir que a través del puente de H el Asp tira del H y el enlace es más largo y el puente de H es más corto. En la misma medida que el Asp elonga el enlace, la His elonga el enlace O-H de la Ser y una elongación de este enlace sobre el O aparece un déficit de carga, no aparece una carga negativa completa pero sí un resto de carga negativa y ese resto en cualquier caso supone incrementar la reactividad de ese O.

Todo favorece al ataque nucleófilo y además está deformado por el agujero del oxianión para que la electrofilia se vaya a la Ser. La triada catalítica lo que hace es iniciar la activación de la Ser. Una vez que se inicia, el O ataca al C carbonílico y se forma el ET. En ese momento, se termina el O de la Ser para formar el enlace covalente con el C y se suelta el protón y la His entonces puede cederle el protón al Asp.

El protón que ha soltado la Ser se lo queda la His manteniéndolo en posición, para que ahora cuando el ET se rompa y se rompa el enlace éster o el amida, el grupo saliente puede llevarse el protón de la His y ésta recuperar el del Asp. Ahora tendremos al Asp con su carga negativa, el primer producto de la reacción y la parte acilo del sustro queda covalentemente unido a la Ser.

La carga negativa, primero una pequeña carga negativa y luego acaba en el oxianión y luego la carga negativa regresa. En ese ir y venir de la carga negativa, viene la activación de la Ser, la formación del ET y la ruptura.

Como esta parte en el sustrato original no tiene interacciones y ya no está unido ni al sustrato ni la Ser, sale del centro activo y cuando sale, el lugar es ocupado por el agua. El protón de la molécula de agua está ocupando el lugar que antes estaba ocupando el protón del grupo saliente y es el lugar que está ocupando el protón de la Ser. Quiere decir que cuando se vuelva a producir la descarga del relé y el Asp tira del protón de la His, ahora la His tira del protón del agua el O del agua es el que se vuelve más reactivo, atacando al C. Antes activaba la Ser, ahora ha activado al agua, produciendo un segundo ataque nucleófilo sobre la acil-enzima y produciendo un segundo ET. Y cuando ese ET revierta para romper el enlace del acil-enzima, la Ser recupera el protón de la His y la His del Asp, es la reacción de desacilación.

Todo el funcionamiento de la triada catalítica se basa en dos descargas del relé (polarizaciones). Una primera que acaba activando la Ser para que produzca el primer ataque nucleófilo y termine en la reacción de activación (acil-enzima) y uno segundo que activa al agua que ataca al C carbonílico que da la segunda reacción (desacilación). Todo se basa en la carga negativa del Asp y la posible transferencia de la carga gracias a ese “cable” de puentes de H entre Asp, His y Ser, donde la Ser es el elemento ejecutor.

Esto fue un modelo propuesto a partir de la determinación de la estructura 3D, pero eso habrá que demostrarlo.

Todo se está basando en el movimiento de protones de un sitio a otro, en casi todas las enzimas suele ser un movimiento de protones lo que lo explica, pero demostrar eso supone ser capaz de posicionar esos protones en cada etapa de la reacción.

Lo que uno no encuentra, es posicionar los H porque tienen una densidad tan pequeña que no se pueden ver. Pero protones críticos es lo que demostraría que la reacción ocurre así.

Empezaron a salir evidencias en contra del modelo.

Curva de actividad frente a pH: pK2 del amino terminal y el pK1 de un aminoácido. El pK1 de 6.5 es de un aminoácido que debe estar desprotonado y en el modelo hay dos que tienen que estar desprotonados para que la enzima tenga actividad (Asp e His). En las tablas de pKa de ionización de los aminoácidos, el de una His está en torno a 6.5. Se propuso que este pKa era el de una His. Había que demostrarlo. Una cosa es el pKa de una His que el de una His de una triada en concreto.

Se encontró una serín-proteasa que tenía en toda su estructura una única His (la de la triada), todas las demás tienen varias His. Cuando se hace un espectro de RMN se obtuvieron una señal de los protones y cada protón tiene un comportamiento determinado: son espectros de muy alta resolución para asignar a cada aminoácido qué protón le corresponde. Esas señales se solapan.

Cuando la His se protona, esta His cuando se protona, tiene una señal de terminada. Cuando se determinó el pKa era de 4.5 y esa proteína tenía un perfil frente a actividad como el anterior mencionado. La His de la triada catalítica tiene un pKa de 4.5 y el Asp lo tiene de 6.5 (tienen los pKa invertidos) los residuos de la triada catalítica tienen sus estados muy alterados. Esta inversión es porque el entorno de la triada es un centro activo hidrofóbico. El entorno hidrofóbico del centro activo favorece a la forma con menos cargas, el menos polar. Para arrancarle el protón al Asp en el entorno hidrofóbico, hay que subir el pH mucho más.

Un Asp normal pierde el protón a pH 4.5, pero aquí hay que subir hasta 6.5. Con la His es lo contrario porque lo que tiene carga es la forma protonada (al revés) en un entorno hidrofóbico va a la forma que no tiene carga. Si quiero protonar la His, hay que bajar el pH mucho más, hasta 4.5, por eso los pKa están invertidos. Uno está desplazado hacia arriba y el otro hacia abajo.

Cuando se hace la curva y se interpreta de actividad frente a pH, como mínimo hay un grupo que debe estar protonado y cuya desprotonación conduce a inactivación ocurriendo a pH 8.5 y otro grupo que debe estar desprotonado y cuya protonación cuando se baja el pH conduce a inactivación a pH inferior a 6.5.

Hay dos grupos que deben estar desprotonados, uno con un pKa de 6.5 y el de 4.5 pero veo uno, porque una vez que el grupo se protona, pierde actividad, no se ve otro cambio porque ya está desactivada de por sí.

La actividad de la enzima sólo aparece a un pH superior de 6.5 y considerando los pKas de los dos aminoácidos de la triada catalítica el punto de partida es con dos grupos desprotonados y solo queda el Asp con carga negativa, la His sin protón y la despolarización desde el Asp hacia la His se puede transmitir a la Ser. HAY QUE SABER DÓNDE ESTÁN LOS PROTONES

Hay técnicas que permiten determinar la posición de protones, por difracción de neutrones.

Se encontró que el protón de la His nunca pasa al Asp durante toda la catálisis, el Asp nunca deja de estar desprotonado.

Hay que reconducir el modelo. 

Si el Asp se desestabiliza, una forma de contrarrestarlo, es que el Asp tienda a protonarse y perder la carga, tira del protón y haría que la His tire del protón también. Sabemos que el Asp no tira del protón o no lo suficiente, la inestabilización debida a la desolvatación puede contrarrestarse protonando al Asp, la carga negativa se hace inestable en un entorno hidrofóbico y se debe poner entonces una carga positiva que compense esa carga. El Asp puede obtenerlo de la protonación de la His, si la desestabilización supone un problema, la mera presencia de esa carga negativa sobre la His, la His tira del protón y activa la Ser que cuando produzca el ataque nucleófilo y la formación del enlace covalente, la His se carga positivamente. Carga negativa en el Asp, positiva en la His y negativa en el oxianión. El efecto es el mismo, el Asp induce la polarización de la His que traslada a la Ser por el hecho de poner la carga negativa al lado. El Asp no interviene en la reacción en términos de soltar y tomar protones. Tiene un papel estructural en poner la carga negativa al lado de la His. En las dos etapas: en la etapa de acilación la polarización sobre la His activa a la Ser y en la segunda, activa el agua.

El Asp es un inductor de la onda de polarización. Si se protona el Asp, se pierde la actividad.

¿Y el protón de la Ser en su unión o no a la His?

¿Para un sustrato tipo amida, que sería el sustrato real de estas enzimas?

Los ésteres tienen una cinética distinta a la de las amidas.

La amida tiene una estructura de resonancia que hace que los enlaces no sean sencillos ni dobles, sino “medio dobles” que hace que estos tres átomos con el doble enlace deslocalizado estén en el mismo plano, formando una estructura aromática. Porque hay un enlace y medio y otro y medio y se tienen dos dobles enlaces entre tres átomos que están compartiendo dos pares de electrones. Uno del del doble enlace C=O y otro que tienen todos los N en un orbital (pi) que no utilizan para formar un enlace y que hace que tengan un propiedad determinada y hace que se forme una nube compartida por igual entre los tres átomos. Cuando se activa el O de la Ser, la reactividad del O es la carga negativa dirigida para formar el enlace con el C. Cuando el O manda su carga negativa contra el C.

El O mete la carga negativa al C y ese par de electrones se dispersan y ya no están deslocalizados, el que va al O es el par de electrones que forma el oxianión cuando acabe la reacción y el par que se van al N vuelven a estar en el orbital y hace que el N en cuanto empezó la reacción, ahora pasa a ser un N amínico alcalino, es alcalino porque se protona gracias a ese par de electrones. A partir de este momento, el N pilla los electrones del protón de la Ser que está al lado.

El relé manda un poco de carga negativa al O que es suficiente para iniciar la reacción y basta con que esta poca carga negativa se oriente hacia el C para que ya los electrones del enlace peptídico se localicen sobre el O y el N, y ahora ese N le quita el protón a la Ser. Pasando desde la Ser hasta el producto, sin pasar por la His. El propio sustrato es el que le quita el protón a la Ser. El producto per se tiene la avidez antes de que la reacción se dé. Esto sólo pasa con las amidas en la primera etapa ya que luego llega el agua y continúa, porque los ésteres tienen un –OH, es la diferencia intrínseca en la primera etapa entre ésteres y amidas.

Caso particular de la hidrólisis de un enlace amida: El Asp con su carga negativa que no pierde nunca (nunca se protona), todo lo que pasa ocurre entre la His de la triada catalítica y la Ser, una vez que entra el sustrato Inducción de la protonación de la His a costa de la Ser (el inicio de la reacción), el Asp se desestabiliza por la desolvatación, pero cuando entra en el sustrato supone mayor hidrofobicidad y la inducción de un inicio de carga positiva sobre la His como consecuencia del acortamiento de ese puente de H y el alargamiento del enlace da la aparición de una traza de carga negativa del O que es mayor reactividad que el O sin someterse a este ambiente. Basta con la aparición de esa pequeña carga negativa sin la necesidad de que le O termine de soltar el protón, como esto se orienta porque todo está colocado previamente hacia ese C, en el enlace peptídico (tiene nube electrónica con dos pares de electrones deslocalizados) y cuando el O orienta su carga negativa hacia el carbono, el enlace peptídico que antes de entrar cuando aparece la carga negativa, está repeliendo los dos pares de electrones que se van cada uno a su sitio, uno al O y va a ser el par de electronces que formará el oxianión y el otro par de electrones se va al N y hace que el N se convierta en un N alcalino (como todos los grupos aminos), los grupos amino tienden a protonarse. Los N de las amidas no, porque el par de electrones no está sobre el N. Esta transformación que se produce exclusivamente por la aparición de carga negativa es lo que termina desencadenando la reacción porque el N se hace alcalino o tiene avidez por un protón y por tanto, el que capta el protón es el propio sustrato.

El N le arranca el protón a la Ser de manera que simultáneamente, el O forma un enlace con el C y esto da lugar al ET. El N del grupo saliente ya tiene el protón. El protón pasa de la Ser al grupo saliente.

Cuando se rompe el ET, el grupo saliente se lleva el protón. Cuando se rompa el ET; si se rompe entre el C y el N, se tiene el final de la reacción de acilación. El Asp nunca gana ningún protón, siempre tiene carga negativa, la His no ha hecho nada, mas que transmitir la polarización (iniciador).

Se tiene el grupo amino libre que no tiene interacción con el centro activo (se va del centro) y la parte acilo que está unida covalentemente a la Ser. A partir de ahora, la reacción es común a la anterior. En esta segunda parte, la His sí se lleva el protón (en este caso el del H2O).

His: papel activador pero no de transferencia de protones, pero en la segunda etapa sí, el O del H2O. Ahora cuando el Asp induzca la polarización de la His, la His tirará de ese protón e inducirá la carga negativa sobre el O del agua, el mismo efecto activador de la His ahora se proyecta para activar el H2O. Con lo cual se produce el segundo ataque nucleófilo por parte del H2O sobre el C carbonílico y se forma un segundo ET.

Pero para que se forme el enlace entre el O y el C, el agua debe soltar el protón y la His se quedará con ese protón; el O del agua entonces forma a la vez el enlace covalente. Cuando el ET evolucione a la ruptura de enlace acil-enzima, la Ser va a recuperar el protón a partir de la His y da el final de la reacción.

La His actúa como catalizador base cuando el sustrato es un éster y cuando es amida, la His no hace de catalizador base en la primera etapa (no se protona). Esto explica por qué la constante de velocidad es distinta entre ésteres o amidas.

La diferencia es si la primera etapa es más o menos desfavorable en comparación con los ésteres o las amidas. Un grupo del propio sustrato es el que participa en la reacción, en este grupo al quitar con la alcalinidad que gana el N y quitándole el protón a la Ser, este grupo está haciendo un papel de activación de la Ser y la hace que esté avocada a formar el enlace covalente, tiene un papel catalítico. Se le llama CATÁLISIS ASISTIDA POR SUSTRATO. Es muy frecuente, en el centro activo de la enzima se aprovecha todo para mejorar la catálisis.

Un conjunto de fenómenos que suman una contribución que darán varias órdenes de magnitud para la catálisis: catálisis por aproximación, covalente, ácido-base, distorsión y asistida por sustrato.

La alcalinidad que gana el N hace que la k2 sea inferior.

Esto explica el mecanismo de reacción para varias enzimas más. Lipasas, acetil hidrolasa, acetilcolinesterasa, β-lactamasa.

β-lactamasa sigue el mismo principio. Un grupo inductor de polarización, uno que pueda hacer catálisis ácido-base que pueda transmitirlo y otro grupo que haga catálisis covalente.

TIOL-PROTEASAS

Muy parecidas a las serin-proteasas. El ataque nucleófilo lo produce una Cys (reactiva) y no necesita estar en una triada catalítica muy elaborada. His-Cys es un par tiol-imidazol. Funciona igual, como la Cys es suficientemente reactiva, no hace falta un activador por polarización inducida por el Asp. La Cys participa como nucleófilo y la His que es el catalizador de reacción ácido-base. La Cys hace el papel de la Ser en las serin-proteasas, pero hay una reactividad intrínseca de la Cys. La papaína es una enzima de este tipo.

ASPARTIN-PROTEASAS

No hay intermedio acil-enzima. Activa el agua directamente, hay dos etapas sin intermedio acil-enzima, un único ataque nucleófilo, un único ET, pero es un mecanismo muy eficiente, más que la de las serin-proteasas.

La pepsina es una enzima de este tipo.

Dos Asp son los responsables del mecanismo catalítico.

La pepsina es una endoproteasa, por eso el centro activo es amplio. Es la primera que hidroliza los enlaces peptídicos, son dos dominios yuxtapuestos que cada uno de ellos aporta un Asp. Esto sólo funciona cuando los dos dominios están en la posición adecuada.

El pepsinógeno la estructura es idéntica, pero con una extensión (segmento de 40 aminoácidos) que tiene que cortarse. Está metido justo en el centro activo, hasta que no se quite, no se activa. Se separa por hidrólisis por cambio conformacional de la proteína por pH ácido, la luz gástrica por una concentración de HCl determinado hace que el péptido se despliegue y se autohidroliza.

Doble mecanismo de seguridad, las células de la pared gástrica sintetizan la pepstatina. Es un inhibidor de pepsina. Evitar que se active dentro de la célula.

Es un inhibidor peptídico, en este caso, con siete aminoácidos. Hay un aminoácido que es la estatina que es un aminoácido no proteico que da un C hidroxilado que simula el ET porque es tetraédrico, es un análogo del ET porque es el inhibidor más potente que hay. Es una estructura muy potente para inhibir cualquier tipo de proteasa. No sólo la pepsina.

La proteasa del virus del SIDA es homóloga a la de la pepsina, en este caso la estructura es un dímero, hay un eje de simetría perfecto. En la pepsina es pseudosimetría. Supone mantener una actividad con la mitad del tamaño el tenerlo en forma de dímero.

La proteasa del HIV es de 90 aminoácidos. Da lugar a un dímero funcional, tan funcional como la pepsina. Los aminoácidos de la pepsina deben ser accesorios.

La pepsina es muy inespecífica, puede hidrolizar cualquier proteína, mientras que la de HIV es muy específica. Esta proteasa es una de las pocas que aporta el virus por sí mismo: transcriptasa inversa, integrasa y proteasa. Esta proteasa madura los precursores de las proteínas del virus, procesa sólo las proteínas virales y en puntos muy concretos.

En el HIV hay un eje de simetría perfecto.

Las posiciones de los dos Asp en el HIV y la pepsina son idénticas.

Esta proteasa fue la primera proteína sobre la que se empezó a investigar, por su simplicidad, por tener tan pocos aminoácidos. Curioso que sea una enzima parecida, pero que sea una de las tres que hay en el virus que se haya conservado, ¿Por qué no una la pepsina animal?

  • El pH de activación es un pH ácido. Las aspartin-proteasas suelen actuar a pH ácido, pero esta del HIV actúa a pH neutro y casi básico.
  • La pepsina es una proteína muy inespecífica. La proteasa del HIV es muy específica porque sus sustratos son solamente las proteínas virales y dentro de ellos, enlaces peptídicos muy concretos para dar lugar a las otras proteínas de los virus como las de la cápsida.
  • La proteína más específica es la más pequeña.

La proteína es tan simple, que se ha logrado sintetizar químicamente que daba una proteína igual de activa y con las mismas características.

Se sintetizó una versión de esta proteína con D-aminoácidos. Los 90 con D-aminoácidos en lugar de los L. No funcionaba esta proteína, a no ser que se le proporcione sustratos todos D, esto demuestra hasta qué punto la especificidad es importante.

El centro activo está ocupado por un inhibidor, el centro activo es mucho más cerrado de la proteasa del HIV, y cuando se une el inhibidor, el centro activo es todavía más cerrado ya que se produce un cambio conformacional (ajuste inducido) experimentada por la enzima que afecta al centro activo como consecuencia de la formación del complejo ES. Una parte de estas interacciones se usan para disparar este cambio de conformación. En casi todas las enzimas, este cambio forma parte de la eficacia catalítica. Este cambio da lugar a una estructura que desde el punto de vista catalítico es más eficiente.

Si se cierra más, aumenta el factor entrópico, mejora la desolvatación, inmovilización, muchas veces los residuos catalíticos se terminan de colocar en su sitio. En muchos casos, sobre todo en enzimas con sustrato muy grande, tiene que estar muy abierto y dificulta el posicionamiento de los aminoácidos. El centro activo es abierto, pero cuando se une el sustrato, se ajusta y terminan de colocarse los residuos que deben entrar.

Entra con el tema de la flexibilidad del centro activo ya que debe soportar cambios conformacionales y si es más flexible, lo hace más endeble a desnaturalización. Este cambio es responsable de que la enzima actúe a pH neutro y la otra a pH ácido.

¿Por qué la pepsina necesita pH ácido y la proteína del HIV neutro?

Porque la pepsina a pH ácido, los aminoácidos deben tener el estado de protonación adecuado. Y la otra tiene el estado de protonación adecuado a pH neutro. Pero son iguales los residuos.

Un Asp tenía el pH neutro porque estaba en un entorno hidrofóbico. Los Asp de la proteasa del HIV están en un entorno hidrofóbico porque la proteína está más cerrada.

Si se analiza el perfil de actividad frente a pH.

Al menos tiene un grupo con pKa de 1.5 que debe estar desprotonado a ese pH y otro grupo al menos que debe estar funcionando en un estado protonado a pH 3.5 y ese grupo pasa de estar protonado a desprotonado a ese pH. Estos dos grupos son los dos Asp de la pepsina. No hay más grupos.

Con el HIV pasa lo mismo, uno debe estar protonado y el otro desprotonado. Están en el mismo entorno, uno está protonado y el otro desprotonado.

Ácido maleico

Cundo se pierde un protón, ese está formando un puentede H con el carboxilo y hay una nube de carga negrativa entre ellos. Quitar el primer protón es muy fácil, pero ya quitar el segundo protón es más difícil porque las cargas están deslocalizadas.

Es lo mismo que pasa con los Asp. Entre estos tres estados está uno que comparte el protón por puente de H. El protón en realidad está entre los dos, al 50%. Además de la interacción entre los puentes de H entre los dos carboxilos, hay una molécula de agua fija que no se intercambia, que está formando un puente de H con los dos carboxilos.

En las serin-proteasas el problema de que el agua sea poco reactivo, es añadiendo un grupo (grabación).

En las tiol.-proteasas algo parecido, la enzima ofrece una Cys que es más reactiva y no tiene que activarla y eso soluciona el inicio de la reacción.

En las aspartin-proteasas, directamente activan el agua desde el principio. La molécula de H2O entre los dos Asp será la molécula de agua que hidrolizará el enlace peptídico, la enzima ya la tiene preparada para que entre el sustrato. El agua ya está en posición. Cuando entra el sustrato, se produce la desolvatación. Se irán las demás moléculas de agua, la que está entre los Asp, se mueve pero no se va. Hidroliza amidas y no ésteres. Cuando entra el sustrato, el O del carbonilo del sustrato, ocupará el sitio donde está el O del agua. El agua se desplaza a otro sitio.

Ahora se tiene el sustrato en posición y el agua al lado, el O del agua ataca al C carbonílico y se forma el ET con el oxianión.

¿Cómo incrementar la reactividad del agua? Poniendo al lado un residuo que actúe como base, que tire del protón y ese grupo puede ser el carboxilo desprotonado. El N gana avidez por un protón y ese protón se lo da el Asp protonado. El estado de protonación ahora está invertido, pero el protón en realidad está entre los dos, el protón del agua reemplaza el protón que han perdido los dos Asp para el grupo saliente. Los dos Asp están desprotonados y protonados para actuar como ácido o base. Tienen eficacias catalíticas bastante mayores que las serin-proteasas dependiendo del pH. En el HIV es así mientras el centro activo sea lo suficientemente hidrofóbico y por eso será con determinados sustratos. Todo es un movimiento de protones, los residuos más importantes son los del centro activo con su capacidad de ceder o captar protones para otros aminoácidos.

Quien quita el protón del agua, siempre hay uno de los aminoácidos que lo quita, es el que queda al lado del agua, cualquiera de los dos puede hacer de catalizador base. Según dónde esté el protón.

La pepstatina es un inhibidor muy potente de la proteasa del virus del SIDA porque es muy similar.

¿La pepstatina sería un buen fármaco? no, porque inhibiría a todas las proteasas.

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