Enzimología 5: Cinética multisustrato

CINÉTICA MULTISUSTRATO

Índice
Se caracterizan en función del número de sustratos y de producto.
Bi bi (bisustrato, biproducto).
El 60% de las reacciones son de este tipo.

A + B → P + Q
uni-uni, bi-uni, uni-bi.

Dos sustratos, para el análisis cinético, se elige uno de los dos sustratos y mantenerlo a concentración constante [B] y ver cómo varía la reacción con respecto a A. Se observa también que se sigue un comportamiento Mickaeliano.

Si aumentamos la [B] aumentándola, sigue también una cinética Mickaeliana, unos parámetros independientes de la concentración de sustrato.

E+ sustratos (A y B) → EA, EB, EAB (posibilidades) y por cada uno de estos complejos, varias posibilidades más.

Entonces se sistematiza el estudio del comportamiento cinético. Definir si el mecanismo es secuencial o no secuencial. Desde un punto de vista cinético, ver si sigue un mecanismo secuencial o no secuencial.

  • Secuencial
    • Ordenado
    • Al azar
  • No secuencial
    • Ordenado

MECANISMO SECUENCIAL

En el transcurso de la reacción sigue una secuencia muy definida de eventos: priemro entran los sustratos y hasta que entran, entonces la catálisis, reacciones y transformación de producto hasta que aparezcan todos los productos y entonces pasa a la salida.

Entrada → catálisis → salida de productos
Alternativa que no sique este mecanismo.

Mecanismo de reacción, entrada, salida de uno, entra otro sustrato, salida del producto, etc. Son completamente distintos, los parámetros microscópicos distintos y los macroscópicos también. Además, se puede encontrar con que aunque siga esa secuencia, luego puede suceder que las entradas de sustrato o salidas de producto sean ordenadas entrada, catálisis salida y que además sea de una manera definida. Hasta que no entra el primer sustrato, no sale el producto, siempre en el mismo orden. Eso es un mecanismo completamente ordenado.

Hay veces que es al azar, no ordenador.
En el no secuencial siempre es ordenado.

MECANISMO SECUENCIAL ORDENADO Bi-Bi
Nomenclatura de Cleland
En los secuenciales siempre hay un complejo ternario, siempre deben estar los tres unidos para dar la reacción. Cuatro intermedios y 10 parámetros cinéticos microscópicos. Las concentraciones de AE, EAB, EPQ los intermedios de reacción se mantienen constantes a lo largo de la reacción.

MECANISMO SECUENCIAL AL AZAR Bi-Bi:
Cuatro complejos binarios y cuatro ternarios. 18 parámetros microscópicos distintos.

Mecanismo no secuencial (PING-PONG):
F: transformación de la misma enzima, por eso no es EP. Es una modificación se su propia estructura química.

Tenemos dos constantes catalíticas: k3 y k-3, k’3y k’-3
La F podría ser una enzima como tal, ¿qué es una F modificada.
Reacción de transferencia de grupo, como una kinasa. Transferencia de P.
Entra antes el donador, por eso es secuencial. Transaminasas, transacetilasas, etc. La propia enzima está fosforilada, aminada o acetilada. En muchos casos la enzima tiene un solo sitio para uno.
A priori no podemos saber si es una secuencial o no secuencial. Ambos, la caracterización del mecanismo catalítico determina si sigue un mecanismo u otro.

Todas dan una ecuación del estado estacionario similar y distinto de la forma que adopta en el caso de los no secuenciales. Cuando se analiza la dependencia de la velocidad de reacción con la concentración de los sustratos, el comportamiento aparente es distinto. En caso de ser secuencial, saber si es ordenado o no y saber cuál es ese orden.

En una reacción bi bi secuencial, se aplica la condición de estado estacionario y se llega a la ecuación de velocidad inicial.

Vm es la Vmax verdadera
Km1 para el sustrato 1
KD1: constante de disociación, cociente entre k1 y k-1.
Experimentar variando S1 y S2, ajustando y se determina Vm, KM1 y KD, etc.

Experimento 1:
S2 constante
S1 variable.

La pendiente y la ordenada del origen dependen de S2. Elegir uno de los sustratos y dejarlos en concentraciones constantes y representarlos en dobles inversos y ajuste lineal.

Repetirlo para otra concentración constante, puede ser una concentración ahora mayor. Y la recta se cortará más abajo, la pendiente será también más pequeña. Se obtiene un haz de rectas con pendientes menores que todas convergen en el eje de abscisas.

Este patrón es típico de un mecanismo secuencial.
Esto no me dice si es ordenado o al azar, ni cuál es el orden.
La primera representación me dice si es secuencial.
Las gráficas obtenidas posteriormente como representaciones secundarias, se obtienen los parámetros macroscópicos.

Ahora en los siguientes experimentos analizaremos las capacidades inhibitorias de los productos. Los productos pueden actuar como inhibidores porque puede formar complejos con P o Q que no darán catálisis. Estas inhibiciones serán distintas con respecto al sustrato que se utilice. Variando A en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de P o Q. Ver si me dan inhibiciones competitivo, mixto o no competitivo. El patrón es distinto dependiendo de si es ordenado o al azar.

Q siempre se unirá a la enzima libre, igual que A. Q compite con A por esa enzima libre. Será competitivo respecto de A, pero no respecto de B, porque no se unen a la misma forma de enzima. B se une a un complejo ES (EA).

Unos inhibidores dan competición mixta y otros competitiva.

Si el mecanismo fuera al azar, P y Q podrían unirse también, sería un patrón de inhibición mixta, supone que los inhibidores se pueden unir tanto a la enzima libre como a los complejos ES.

Pingpong:
La pendiente no cambia según la concentración constante de S2.
Cambia la ordenada de corte 1/Vmapp. Disminuye a medida de la concentración constante de S2 aumenta.
Si hay una dependencia sigmoidea de la velocidad de reacción con relación de la del sustrato. Es un comportamiento cooperativo. Va muy asociado con el alosterismo, porque en muchos casos esta enzima tiene un comportamiento sigmoideo en unas condiciones, que con otros metabolitos tendría un comportamiento Mikaeliano.

Tiene una actividad muy sometida a regulación, por encima de lo que depende la concentración de S. Requiere una especie de activación, hasta que la concentración de S no alcance un umbral, no se dispara la reacción.

En el caso de la fosfofructokinasa, cuando se añade AMP, sigue una cinética Mickaeliana, pero en ausencia es sigmoidea. Se están dando simultaneamente fenómenos de cooperatividad y alosterismo.
Los primeros eventos son lentos y los siguientes más rápidos.
Cooperatividad homotrópica: el mismo sitio. El efector y el efecto es lo mismo, se produce en el mismo sitio. La catálisis del sustrato origina que la catálisis posteriormente se produzca más rápido.

  • La positiva: la catálisis introduce un cambio que hace que la catálsiis de nuevas moléculas de sustrato sea mejor.
  • Negativa: si el cambio da lugar a una situación en que la enzima cataliza peor al sustrato.

Cooperatividad heterotrópica o alosterismo: diferentes sitios. El efecto se desencadena en un sitio y se manifiesta en otro.

  • Positiva: activadores alostéricos
  • Negativa: por inhibidores alostéricos.

Cuando se observa cooperatividad, son enzimas que soportan bastantes niveles de regulación. La cooperatividad es un nivel más de cooperación. Enzimas muy eficientes para mantener el sustrato en un margen muy estrecho.

Se produce en el mismo sitio, ese “algo” en la cooperatividad homotrópica. ¿Cómo es que “recuerda”? para que se acuerde la enzima, debe pasar en tiempo y espacio cortos. Para eso, debe tener una estructura oligomérica. Cuando la enzima cataliza peor las primeras que las siguientes no significa que se trate del mismo centro activo, en el oligómero la primera molécula de sustrato genera un cambio que notan las otras subunidades. Está asociada la cooperatividad a una estructura cuaternaria (oligomérica).

Estamos viendo entonces en la sigmoidea dos estados distintos, que analizados por separado, sigue una cinética michaeliana.

La forma T (tensa) tiene una Ecat menor que la R.
Independientemente si se hicieran los análisis cinéticos de cada forma, da una cinética mickaeliana.
A baja concentración de S, está todo en forma T y por tanto estaría en forma T y entre medias será una mezcla de las dos, dando una sigmoidea. Es la suma de dos cinéticas mickaelianas.
Cuando se curvan hacia arriba, es una cooperatividad positiva. En la de dobles inversos.

Es un sistema de tipo K, se manifiesta entonces a nivel de Km.
Sistemas tipo V, el cambio es a nivel de Km.
Cooperatividad positiva, curvatura hacia arriba.

Los moduladores alostéricos influyen en el equilibrio TßàR. Los inhibidores desplazan el equilibrio a la forma T, y los activadores a la forma R.
El AMP actúa hacia la forma R.

EVALUACIÓN CUANTITATIVA DE LA COOPERATIVIDAD
Determinar el coeficiente de Hill (n)
Mide en promedio cuántas moléculas de s se unen por cada molécula de s que empieza a unirse.
n menor o igual a número de sitios. Cooperatividad máxima cuando n es igual al número de sitios. Cuando una molécula de sustrato se une, es como si al instante se unen todas.

Hb n=2.6
y= fracción de enzima ocupada

log [S] vs log V/Vm-VDebe dar una línea recta, n es directamente la pendiente. Es lineal.
Ver cuánto se aproxima esa n al máximo.
Como y es muy difícil de determinar, usamos la ecuación de V/Vm-V (gráfico 6). Y no usamos la gráfica 5.

Ver cómo se explica considerando la estructura oligomérica, lo que pasa cuando se une la primera molécula de sustrato para que las demás se unan.

Dos modelos:

  • Modelo concertado: propone que en el oligómero de enzima, todas las subunidades están en la forma tensa o la relajada, habría una transición concertada simultánea de todas las subunidades a la vez. Habría dos formas: todo tensa o todo relajada. La constante de transformación sería distinta en función del grado de ocupación. SI no ha unido ninguna molécula, no se produciría el tránsito, y la constante de velocidad sería muy baja, cuando tiene uno de los sitios ocupados la constante de transformación sería mucho mayor.
  • Modelo secuencial: Cualquier posible conformación de formas tensas y relajadas es posible. Cada una tendrá su constantes cinéticas macroscópicas. Oligómeros en los que una subunit estará relajada y el resto tensas. Cuando una une al sustrato, esa tendría favorecida su transición a la forma relajada y el resto tendrán un tránsito más fácil porque la interfase de contacto (transmisión de información) entre las subunidades lo permiten. Cambian las interacciones con las subunidades vecinas que tienen una conformación distinta y cambian a la forma R con constantes de velocidad mejores.

No hay acuerdo sobre qué mecanismo siguen las enzimas en su totalidad. O si es que unas siguen un mecanismo concertado y otras secuencial. Eso sería determinar la estructura 3D en estado de semiocupación. Se pueden estudiar en estado vacío o total de ocupación, si se hace intermedio, sería una mezcla de varios estados y sería la suma de varios estados que están superponiéndose.

Modelo concertado:
La cooperatividad ocurre en las formas intermedias.
Estas subunidades en la forma relajada se unen con más facilidad. Las primeras empiezan desencadenando el fenómeno empiezan desde el estado T y las siguientes con los parámetros cinéticos del estado R.

Modelo secuencial:
La cooperatividad ocurriría, la familidad con las que todavía no se han producido, transitan son más favorables, la subunidad T alrededor de R está siendo influenciada por las demás para obtener el tránsito a la forma R. Esta transmisión ocurre porque ha habido una interfase de contacto.

Es difícil demostrarlo para una enzima en un caso concreto, ver si sigue un modelo u otro, porque saberlo requiere conocer las situaciones de ocupación intermedia.

Ejemplo: Aspartato transcarbamoilasa
This enzyme from Escherichia coli evidently demonstrates the spatial separation of catalytic and regulatory centres on distinct polypeptide chains. The native enzyme molecule consists of six catalytic subunits (C, Mr=33 000), joined in two trimers and six regulatory subunits (R, Mr=17000) that form three dimers, resulting in a (C3)2(R2)3 structure. Catalytic and regulatory centres are 6 nm apart from one another.

The allosteric activator ATP and the inhibitor CTP bind both to the same region at the R subunit. CTP stabilises the T state and enhances the sigmoidal character of the substrate saturation function. ATP preferably binds to the R form and weakens the cooperativity of the substrate aspartate. This also preferably binds to the R form. At the transition from the T into the R state the two catalytic trimers move apart 1.1 nm and rotate by 12 in relation to each other, while the regulatory dimers rotate by 15 around the two-fold molecule axis. Because of this transition several amino acid residues important for the binding of aspartate move towards the active centre and increase the affinity for the substrate. Removal of the regulatory subunits results in the loss of cooperativity and regulation by ATP and CTP, while the catalytic activity is retained. With this enzyme it was also possible to demonstrate the concerted transition from the T state to the R state according to the symmetry model. The occupation of half of all binding sites by the transition state analogue PALA (N-phosphoacetyl-L-aspartate) is sufficient to transfer the entire enzyme molecule into the R state.

Aspartate transcarbamoylase is a good example for feedback inhibition. The enzyme catalyses the initial reaction of the pyrimidine nucleotide biosynthesis pathway and is inhibited by CTP, the end product of the pathway. The activator ATP is the end product of the purine biosynthesis pathway. As for nucleic acid biosynthesis both nucleotides are required in an equal ratio, a surplus of purine nucleotides stimulates pyrimidine synthesis, which in turn is inhibited by a surplus of pyrimidine nucleotides (Kantrowitz and Lipscomp, 1990).

La primera enzima de la ruta para la síntesis de las bases de nucleotidos. Por eso es la que más soporta la regulación. Sigue una sigmoidea y significa que tiene fenómenos de cooperatividad. En presencia de ATP, la curva se hace Mickaeliana, y el CTP la hace más sigmoidea. Eso hace que sean reguladores alostéricos. El ATP desplaza a la forma relajada y el CTP es un inhibidor alostérico que dificulta el tránsito de la forma T a la R.

Esta enzima es heterooligomérica. Tres dímeros de subunidades reguladoras, dos trímeros de subunidades catalíticas. Seis centros activos.

Enzima tipo K, el cambio se manifiesta fundamentalmente a nivel de Km, cambia la afinidad por el sustrato. Los dos trímeros se separan y uno gira con respecto al otro, en esa separación y girlo, las posiciones pasan de estar en contacto a estar liberadas y donde están los centros activos.

EL cambio conformacional parece que es un cambio concertado al ser un movimiento conjunto. O estamos en un estado o en el otro. De manera que lo que dispara ese cambio es que alguna de las seis subunidades se ocupan y cuando más ocupadas estén, más favorable es. Es así porque son las dos únicas formas que hemos visto. No hemos visto un cambio que sólo afecte a una subunidad y no a las otras, hay que ver los estados intermedios lpara llegar a una conclusión sobre el modelo que sigue.

El fenómeno de la cooperatividad requiere estructuras más complejas donde están los reguladores (ATP o CTP), la “pinza” de los dímeros está más cerrada o más abierta. Entonces estos reguladores promueven la abertura o cierre. Están indirectamente empujando a una de las dos interconversiones. Los reguladores alostéricos se unen a subunidades distintas pero el efecto está en el centro activo, el efecto cooperativo sería en una de las subunidades catalíticas.

EXPERIMENTOS EN EL ESTADO PREESTACIONARIO
Todo lo visto hasta ahora eran experimentos en el estado estacionario.

ENcondiciones de estado estacionario los parámetros macroscópicos definen cómo funciona la enzima “a velocidad de crucero” pero en las etapas medias no dice nada. La consecuencia de ello es que da el mismo comportamiento hiperbólico Mickaeliano. No podemos saber si hay etapas intermedias. Para completar la caracterización cinética, hay que salir del estado estacionario.

En el preestacionario se ve cómo la enzima pasa de estar toda en forma libre a ver cómo está formando los intermedios, depende de los parámetros microscópicos. Cosa que no se puede hacer en el estado estacionario. Valores de k1 y k-1.

Estacionario Preestacionario (determinar la situación de todos los intermedios de reacción, hay que poblar estos intermedios)
• Concentraciones de enzima muy bajas [E]≪[S]

• Con lo cual, se mide después de un número elevado de ciclos catalíticos
• Mediciones mayores en tiempos de reacción a 30s. Debemos alcanzar el estado estacionario.

• [E] muy altas y [E]aprox[S], del mismo orden. Debe de medirse antes de llegar al estado estacionario. Sincronizar todas las moléculas idealmente.
• 1 o pocos ciclos catalíticos
• Escala de t en ms o debajo. Supone un desafío técnico. Actualmente este es el mayor desafío. Restricción en el tipo de ensayo cinético que se hace.
• Casi siempre uno trata de buscar ensayos cromogénicos: uso de un tipo de sustrato que sus propiedades espectroscópicas permitan seguir la reacción de manera que sin necesidad de parar la reacción, se pueda parar.

Hay que conseguir que se pueda iniciar y parar la reacción para luego tomar el tiempo necesario para analizar (cromatografía, espectrometría de masas, etc.) qué es lo que ha pasado cuando se ha dejado actuar esta enzima. Es muy costoso, se hace cuando no hay otra alternativa o cuando los sustratos no tienen esas caractersíticas y sólo haya un análogo y demostrar realmente que este análogo siga las mismas propiedades del sustrato. Detectar la presencia de intermedios de reacción para demostrar si de verdad existen.

Técnicas usadas para experimentos de estado preestacionario:

  • Stopped-flow

Técnicas de mezcla rápida: diseñan una forma para asegurar que la mezca E/S sea suficientemente rápida para medir con precisión unos pocos ms después de la reacción. El t0 se define a partir de unos pocos miliseg. No se pueden hacer de forma manual, inyecciones neumáticas que inyectan de forma precisa un volumen rápidamente. La cámara de mezcla asegura que la solución es homogénea en unos pocos ms.

Llega a una jeringa y entonces activa un stop que detiene todo el proceso, el líquido queda parado en la cámara de reacción para que a partir de ese momento se detenga la reacción. Es sólo el volumen que se pierde para parar la reacción. Con 40-50 μL basta. Al incio hay un tiempo muerto de unos milisec, son lo que ocurre en o que pasa la mezcla de reacciónhasta llegar al émbolo. Si hay un intermedio que dura unos poco milisegundos, da tiempo a detectarlo aún, pero si la reacción es más rápido, entonces se pierde esa información. No se puede inyectar más rápido, no se puede más por las propiedades físicas del agua. Para detectar intermedios con vidas medias más rápidas, se usa otra técnica. Es el tiempo muerto.

Se recurre entonces a las técnicas de relajación, eso sí permite hacer mediciones por debajo de los miliseg. Se mide el tiempo 0 de otra manera.

No se puede mezclar más rápido que pocos miliseg, mezclarlos entonces con calma. Dejarla evolucionar en el tiempo al final llegará al equilibrio, definido en función de las propiedades estables. Una vez en el equilibrio, se obtiene una concentración de P en el equilibrio para un estado del sistema determinado, ese estado puede ser a una temperatura determinada, entonces se cambia la temperatura introduciendo una perturbación en el sistema que lo produzca de forma instantánea: temperatura o presión, etc. Normalmente por temperatura.

Está a 37º, se sube ahora a 38º, la concentración de producto en el equilibrio será mayor, irá en la dirección a la formación de P, el sistema subirá de forma en que la enzima pase al estado nuevo. Esto dependerá una velocidad de reacción más rápido de miliseg porque el cambio ha sido instantáneo. Lo que estoy viendo es cómo se relaja el sistema cuando se introduce una perturbación en el equilibrio y dejo al sistema a que se relaje al nuevo equilibrio.

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