Enzimática 4: Activación e inhibición enzimática.

Índice

INHIBICIÓN

  • Irreversible: lo habitual es por modificación de la propia estructura de la enzima, alteración de enlaces covalentes, el catalizador se convierte en una estructura distinta y pierde actividad. La concentración efectiva de enzima es menor al añadir el irreversible y por eso la Kcat aparente disminuye.
  • Reversible: se restaura la eficacia catalítica cuando se elimina el agente inhibidor. No hay modificación permanente, si revierte quiere decir que se debe a la formación de un completo no covalente entre enzima e inhibidor.

INHIBICIÓN IRREVERSIBLE

Produce una modificación permanente, una alteración de la Kcat permanente y normalmente por una modificación química covalente porque en algunos casos la irreversibilidad se debe a una alteración estructural muy grande sin que el elemento esté interviniendo allí y la modificación es tan grande, que no “vuelve atrás”. Un agente caotrópico como la urea o cloruro de guanidinio. Cuando se eliminan estos agentes por diálisis, la enzima no se repliega y no recupera la estructura activa original.

MODIFICACIÓN COVALENTE

No todos los aminoácidos son igualmente susceptibles. Normalmente los más susceptibles a modificación son las Cys (estos son unos de los aminoácidos más reactivos y modificables), los grupos NH2 (terminal como los de las cadenas terminales), los COOH o los de la cadena lateral, la cadena de la His, los –OH. La mayoría son polares. Los hidrofóbicos no se modifican normalmente, son muy poco reactivos.

Si se ponen en presencia de un agente que pueda modificar los aminos, sulfidrilos, hidroxilos, etc y resulta que uno de esos aminoácidos, juega un papel principal en la catálisis, lleva a la inactivación.

El uso de agentes modificadores químicos selectivos de grupo ver si se pierde o no actividad. Si es drástico, podemos ver la presencia de aminoácidos esenciales en el centro activo que participen en la reacción y los críticos en la catálisis enzimática.

Incubar la enzima en presencia de diferentes concentraciones de determinados agentes químicos: agentes de aminos, sulfidrilos, imidazoles, etc. Coger un reactivo químico y ensayar cómo afecta la Kcat cuando se ha incubado la enzima a diferentes concentraciones de ese agente.

Si eso pasa a concentraciones relativamente bajas (μM), debe estar relacionado con una modificación covalente de un sitio crítico para la actividad y se puede concluir que hay determinado aminoácido esencial en el centro de actividad.

Si la modificación es covalente, se puede saber cuántos aminoácidos se han modificados por la incubación. Como es permanente, puede usarse una forma del agente modificador marcado con fluoróforo o radiactivamente. Eliminar por diálisis y ver cuánto de marcador permanece.

Si se pierde una actividad completa para todas las enzimas, y 1mol de enzima queda inactivado por 1mol de inhibidor, podría decirse que se une una molécula de inhibidor.

Lo normal es que la estructura no se vea alterada, aunque se haya unido. En una proteína suelen haber muchas cys. Jugar con el tiempo de incubación y la concentración de inhibidor, se incuba con tiempos diferentes y concentraciones diferentes de inhibidor para que salga más o menos que se incorpora 1 mol de agente por mol de enzima.

Al ensayar la actividad enzimática, lo ideal es que pierda al 100%. Si ajusto las condiciones de marcaje para unión de un grupo por molécula de enzima, si tiene un grupo Cys, es que pierda el 100%de actividad. Si tiene varias Cys, cuando se restringen las condiciones de marcaje, puede pasar que en una molécula esté modificada una Cys, y la otra no y se pierde aún así el 100% porque la más reactiva. Si se ponen unas condiciones limitantes, la que se modifica es la más reactiva. La probabilidad de modificación de esta, es mayor.

Por tanto, si se usa de una forma muy limitante, lo más probable es que se modifique la Cys más reactiva. La modificación de un único residuo de Cys es esencial para una inactivación, pero todavía no sabemos sobre cuál se ha unido, ver en qué trozo está incorporado y ver si siempre es el mismo.

Puede pasar que cuando se marca y une, no ha unido exactamente a una Cys, sino a un Trp.

El hecho de que se tenga un agente selectivo de Cys, no me permite decir que es un residuo de Cys hasta demostrarlo experimentalmente.

Aún no sabemos si puede ser un residuo crítico o no.

Si se hace una incubación en presencia de un análogo del sustrato o de producto o del estado de transición, se esperaría que en las mismas condiciones en marcaje, se vea mucha menos inhibición. El sustrato protege parcialmente el centro activo.

Si usamos un agente selectivo de Cys que se parezca al sustrato, la probabilidad de que modifique en la proximidad del sitio catalítico es mayor. Esto se llama MARCADOR DE AFINIDAD. Reúne las dos características: parecerse al sustrato y tener la capacidad de formar un enlace covalente irreversible.

Requiere saber más de la enzima, más sobre su estructura 3D y qué parte del sustrato se une al centro activo. Si se puede diseñar esto, estos inhibidores son muy potentes.

Lo ideal sería, poner además un grupo que no sea tan selectivo, se utiliza un marcador de afinidad que tiene un grupo reactivo que no tiene actividad (no produce modificación química) pero que cuando se expone a determinada λ se modifica y genera un radical libre que hace que se convierta en una molécula muy reactiva. Esto es una SONDA FOTOACTIVA. Y con ello la modificación irreversible. Eso permite que determine en el tiempo y espacio determinado que se active y se una irreversiblemente.

Se une, hasta que se da el haz de luz, queda totalmente unido irreversiblemente.

Marcador activable por un estímulo externo, la propia catálisis de la enzima puede activarlo. La consecuencia de la catálisis sea la aparición de un grupo que sea capaz de hace esa unión irreversible. Es el inhibidor perfecto, hasta que no se una la enzima y no resulte catalizado, entonces se queda unido totalmente: SUSTRATO SUICIDA. Es el inhibidor perfecto, entonces nunca habría producto. Sería el fármaco perfecto.

Esto requiere conocimiento total de la geometría de la enzima.

INHIBICIÓN REVERSIBLE

Introducir el inhibidor como un reactante más en el esquema cinético.

Da como resultado una menor eficacia catalítica.

EI, ESI son intermedios de reacción. En condiciones de estado estacionario estos complejos deben ser constantes. El inhibidor no se cataliza, no desaparece.

Da una ec general para todos los inhibidores reversibles, difieren entre sí en función de cuánto valen Ki y Ki’

INHIBICIÓN COMPETITIVA

Vmax no cambia.

KI’ es muy grande todo va desplazado a la disociación, prácticamente no se une al complejo ES.

Con lo cual el término [S] desaparece. La velocidad de reacción entonces es

Sólo se une a la enzima, no hay complejo ternario, eso pasa cuando el inhibidor y el sustrato se unen en el mismo sitio. Entonces compiten por la unión a ese sitio la Km aparente será mayor a la Km cuanto menor sea KI. Tanto mayor cuanto mayor sea la concentración de inhibidor y cuanto mayor sea la afinidad.

Hay una cantidad menor del complejo ES, por tanto, es lógico ver una catálisis menor. Si se aumenta entonces la concentración de sustrato, se puede llevar a la Vmax entonces ese equilibrio se puede disociar y acaba por haber ES.

Concentraciones relativas S vs I y de las afinidades relativas.

Entonces la Vm es la misma.

Representación en dobles inversas (ec 5)

Se tendrá una Km mayor, corta antes al eje de las x y da unas rectas que van incrementando la pendiente según aumenta la concentración de inhibidor.

Experimentos: cinéticos calculando o determinando la velocidad de reacción para diferentes concentraciones de S en ausencia y luego de presencia de inhibidor con diferentes concentraciones de I. Entonces dará una distinta Km aparente.

Se puede representar Km frente a la concentración de [I] y entonces se puede determinar KI que es el parámetro cuantitativo que define el poder inhibitorio de este competidor.

KI’ ES MUY GRANDE Y NO SE DA EL COMPLEJO TERNARIO

EFECTO EN KM

INHIBICIÓN NO COMPETITIVA PURA

Aquí ya no se puede despreciar KI ni KI’ KI = KI’ el inhibidor tiene exactamente la misma afinidad por la enzima libre que por el complejo ES. Eso pasa si se unen en sitios distintos.

Es específico cuando KI = KI’.

Entonces los términos de la ec. 4 son idénticos y se obtiene (ec.5)

Vmapp será siempre menor que Vm en ausencia del inhibidor.

EL inhibidor produce una reducción de la velocidad máxima.

Una reducción aparente del índice de turnover, tanto mayor sea la KI.

Tiene la misma Km, pero menor velocidad máxima y se corta en una mayor ordenada.

Eso ocurre cuando KI = KI’, pero en el caso general no ocurre.

Cuando esto ocurre, se cortan en otros cuadrantes.

Se ve un efecto aparente sobre la velocidad max y sobre la Km, de los efecto de cada un ode los dos, se dedice KI o KI’. Por tanto ya no se llama INHIBICIÓN NO COMPOTETITIVA, SINO INHIBICIÓN MIXTA.

Entonces la inhibición no competitiva pura es un tipo de inhibición mixta.

INHIBICIÓN ACOMPETITIVA

KI’ ES MUY GRANDE

El inhibidor no se une a la enzima libre, sino casi en exclusiva al complejo ES.

Pasa cuando en el sitio el inhibidor tenga que tener interacciones también con el S, o cuando se une ES hay una conformación y entonces puede unirse el I. Entonces hay complejo ternario pero no binario.

Entonces uno de los denominadores se acerca a 1 entonces la ecuación es la siguiente:

Vm y Km resultan afectados. Esta Vm será siempre menor que la Vmapp.

Km app también dividida por el mismo término, entonces Km > Kmapp reduce la Km y reduce la Vm.

Recordar que la Km refleja la cantidad de complejo ES, pero lo que hace el inhibidor es secuestrar al complejo ES en forma de complejo ternario ESI. Entonces las rectas se van cortando en ordenadas mayores, también se va a ir yendo a más abscisas y se va a ir a un haz de rectas paralelas con la misma pendiente.

Todos los inhibidores se comportan como alguno de estos tres patrones.

INHIBICIÓN POR EXCESO DE [S]

Concentraciones de sustrato hay una pérdida de velocidad a medida que aumenta S, cuando aparece eso es porque hay una inhibición por exceso de sustrato. Si hay un exceso de S1 la reacción se inhibe, si hay demasiada concentración de S1, puede dar a la formación de un complejo ternario que en lugar de tener dos sustratos distintos para dar el producto final, hay un complejo ternario con dos sustratos iguales y no procede la catálisis. Esta segunda molécula de S1 se comporta como un inhibidor del tipo acompetitivo.

Si tenemos una enzima que une dos sustratos:

E+S1 → ES1 + S2 → ES1S2 →EP1P2

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