Enzimática 3: Influencia de factores ambientales en la catálisis enzimática.

INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN A LA CATÁLISIS

Índice
Sin necesidad de estudios en el estado preestacionario se puede obtener más información sobre la catálisis.
Cómo se afectan las variables macroscópicas según variables ambientales.
Factores físicos: temperatura (muy importante) y polaridad
Factores químicos: fuerza iónica (tipo de iones en el medio), pH (muy importante), todo tipo de compuestos que cambien aparentemente la eficacia catalítica (INHIBIDORES).

  • Inhibidores reversibles: produce una reducción de la eficacia y al eliminarlo, la enzima recupera la eficacia original.
  • Inhibidores irreversibles

TEMPERATURA
Saber a qué temperatura la enzima va a funcionar. Estudio cinético a diferentes temperaturas, para cada temperatura, definir los parámetros cinéticos macroscópicos y determinar la Kcat según la temperatura. Al inicio, no hay reacción, luego sigue una fase exponencial hasta un estadio estacionario al límite en que ya no se ve actividad.
Normalmente casi todas las enzimas siguen esta gráfica.
Sufren procesos de desactivación térmica. No tiene actividad o actividad parcial. Tanto a alta, como a baja temperatura.
En el momento del crecimiento exponencial, es debido al mayor número de choques, además la viscosidad es menor, los encuentros se aumentan. Cualquier reacción es más alta según la temperatura y la dependencia viene definida por la ecuación de Arrhenius, tiene una dependencia exponencial.
Si se representa el lnKcat frente a la inversa de la temperatura, nos da una dependencia lineal.
La pendiente es = -delta/ Ea/R
Tenemos otro parámetro: energía de activación.
Esto se lleva hasta un límite, la enzima en algún momento cambia por un aumento por encima del umbral y catalizaría con otros parámetros cinéticos distintos. Y nos da una Kcat mucho menor, aunque todavía haya alguna actividad, pero se ha empezado un fenómeno por desactivación térmica por altas temperaturas. EN el momento en que ya no funcione, se trata de una desnaturalización. Cambia el plegamiento, al incrementar la energía térmica, se incrementa la energía vibracional, se mueven los átomos y son capaces de romper la energía de esas interacciones y ese pegamiento ya no es estable y da el cambio estructural total. Se afecta el centro activo y se tiene pérdida de la actividad.

Por encima de un valor hay desactivación, térmica total por la desnaturalización de la enzima y otra porque la velocidad de reacción es menor que la que debería de ser por forma exponencial.
A temperatura muy baja, la viscosidad del medio y la cinética es muy baja, por eso la desactivación.
Si se analiza una enzima con respecto a la temperatura y a los 20º ya se desnaturaliza (ENZIMA PSICRÓFILA). Hay otras enzimas que son las Extremotermófilas que se desactivan a 50º y a 80ºC.
¿A qué se deben las desactivaciones a altas y bajas temperaturas?
Se han originado proteínas quiméricas a partir de proteínas homólogas.

Se preincuba la enzima en un tiempo a diferentes temperaturas antes e ensayarlas a su temperatura óptima, se mira la actividad residual y nos indica que hasta qué punto la desactivación, lo que sea que pase, es reversible. Se puede necesitar en el procesamiento de la mezcla de reacción, se debe exponer la mezcla de reacción a otras temperaturas.

Cloruro de guanidinio hace lo mismo que la urea, son agentes desnaturalizantes porque interfieren en los enlaces de H+ (agentes caotrópicos)

CD: dicroísmo circular (evaluación de la struct secundaria)

Dispersión de luz: si en el medio hay una solución o una dispersión, cuando se ve eso, es porque las proteínas han precipitado, pierden la solubilidad en forma de turbidez porque el desplegamiento de la proteína hace que se muestren zonas hidrofóbicas al medio y forman agregados al ser hidrófobas.

Fluorescencia: se va perdiendo antes de la CD y el scattering, depende de los aminoácidos aromáticos, efecto de entornos específicos alrededor de los aminoácidos aromáticos, son entornos que aunque cambien muy poco, dan efectos muy grandes en su entorno.

Actividad enzimática: Mucho antes de os fenómenos estructurales, la actividad cae, el efecto se produce a menores concentraciones de efecto caotrópico que los efectos estructurales.

Con la temperatura para exactamente la misma, la actividad SIEMPRE ES MUCHÍSIMO MÁS SENSIBLE A LA TEMPERATURA QUE LA ESTRUCTURA.

La actividad enzimática es muy lábil con la temperatura, es más sensible que la estructura, temperaturas que no son muy altas que no alcanzan el nivel de desnaturalización son suficientes para la pérdida de actividad de la enzima.

Lo que pasa entonces es que un grupo fluorescente exógeno a la proteína que reacciona covalentemente con un aminoácido del centro activo, cualquier efecto en las propiedades de ese grupo se pueden asignar a propiedades en el centro activo para que quede unido a un aminoácido del centro activo.

Ahora todas las curvas son paralelas, si se miden fenómenos estructurales a nivel del centro activo, el cambio es paralelo a la actividad. Se ven afectados al mismo tiempo tanto estructural como de actividad.

Este fenómeno de desactivación es debido a la perturbación de la estructura de la proteína EN EL CENTRO ACTIVO, eso quiere decir que esas concentraciones tan bajas, la estructurad e la proteína no se ha alterado y el centro activo sí, es particularmente susceptible a perturbarse. Eso hace que una enzima sea particularmente lábil con relación a cualquier proteína.

Evolución para que la parte más frágil sea el centro activo. Debe haber una ventaja evolutiva.

La estructura 3D es muy parecida, pero hay características estructurales son distintas en enzimas termoestables.

ENZIMAS TERMOESTABLES:
Aparecen más aminoácidos hidrofóbicos en el interior del plegamiento
Más aminoácidos polares en el exterior
Disminuyen potenciales puntos de desestabilización.
Tienen más puentes salinos, interacciones electrostáticas entre aminoácidos de carga opuesta que quedan cercanos en su estructura 3D.
Tienen más puentes S-S porque son interacciones covalentes que dan muchísima estabilidad. Es un entorno trementamente estable, una vez que se da el plegamiento, ese plegamiento queda fijado una vez hecho. No contribuyen durante el plegamiento, pero una vez plegadas, se quedan aseguradas.
Disminuye de manera muy drástica el número de residuos de Gly es donde hay menos impedimentos estéricos y es un punto intrínseco de flexibilidad (ángulos de ramachandran). Las gly son puntos de gran flexibilidad.

Todos estos cambios han acumulado características de estabilización y pierden de desestabilización.
Las psicrófilas les pasa JUSTO LO CONTRARIO, ESTÁN LLENAS DE GLY.
Los que optimizan las enzimas a la temperatura a la que deben funcionar es UN ADECUADO NIVEL DE FLEXIBILIDAD. Si deben hacerse resistentes a altas temperaturas, deben ser MUY RÍGIDAS, si deben funcionar a baja temperatura, deben ser mucho más flexibles.
Las termoestables, son tan rígidas que a 50º son demasiado rígidas. Las psicrófilas se ven desnaturalizaciones a 20º que las hace tan endebles y flexibles que se desactivan.

EL CENTRO ACTIVO DE LAS ENZIMAS ES LA PARTE MÁS FLEXIBLE DE LA MOLÉCULA, por eso es la parte más lábil de la enzima. Y cuando baja demasiado la temperatura, se hace demasiado poco flexible. Actúan en un rango óptimo de flexibilidad del centro activo. LOS CENTROS ACTIVOS SON MOVIMIENTOS MECÁNICOS QUE AYUDAN A INCREMENTAR LA EFICACIA, por tanto la temperatura y flexibilidad son críticos.

Incluso a una temperatura determinada que está actuando puede hacer que la enzima deje de tener actividad. Como mantener a una enzima a 30º constantemente puede desactivarla.

POLARIDAD DEL MEDIO
Polaridad del disolvente, normalmente con disolventes acuosos. Añadir un disolvente distinto del agua cuya polaridad sea inferior, normalmente siempre es inferior al H2O.

Hablamos del efecto de diferentes disolventes, polares o no, miscibles o no en agua. Se puede añadir una proporción de un disolvente menos polar pero miscibles en agua, en una proporción que se quiera, la polaridad dará una intermedia entre la del agua y la del disolvente en relación con las fracciones usadas. Se puede ver qué efecto tiene en la catálisis. Si se reduce mucho la polaridad, prácticamente un 20% de metanol, se ve una desactivación, una pérdida completa de la actividad catalítica.

El plegamiento está definido por el efecto hidrofóbico que hace que la secuencia de unos aminoácidos se dé según el medio. Los polares hacia afuera y los hidrofóbicos hacia adentro (EFECTO HIDROFÓBICO). Si el entorno ya es menos polar, la disposición de los aminoácidos cambia, puede haber entornos locales en los que en promedio haya más aminoácidos hidrofóbicos dentro que fuera. Puede haber un equilibrio inestable que al cambiar la polaridad del medio, los que estaban dentro, arrastran otros que eran hidrofóbicos que estaban dentro y ahora quedan fuera.

Son muy sensibles a cambios en la polaridad, normalmente los disolventes usados, a un porcentaje mayor al 15 o 20% son FUERTEMENTE DESACTIVANTES eso si el disolvente es miscible en agua. Si es no miscible en agua, la adición de mucho menores da un efecto mayor.

Como el cloroformo, aunque se añada una alícuota muy pequeña, se tiene un sistema bifásico en el que se tiene agua y pequeñas gotas de cloroformo y la polaridad es la del cloroformo puro y basta que conecte con una de ellas y desactive totalmente la enzima. Hay una gran desactivación porque una parte de la proteína se va para una fase y la otra al otro. Por eso se utilizan para parar inmediatamente una reacción y luego se utiliza para analizar la reacción.

Tiene un interés biotecnológico importante porque en la industria es muy fácil que se necesite poner disolventes orgánicos. Se tiene que separar el producto obtenido de la reacción completa, en la escala industrial, las separaciones más convenientes desde un punto de vista de coste/rendimiento es por uso de disolventes orgánicos. Si se puede aplicar una extracción con disolventes orgánicos, mejor. Se tiene que extraer la enzima aunque esté parcialmente dañada. Es difícil que soporten a concentraciones grandes de disolventes.

Ahora ha cambiado esto, con los experimentos de Klyvanov. Demostraba que en determinadas condiciones puedes transferir enzimas y mantener su actividad incluso en cloroformo.

  • Efecto de los disolventes orgánicos
    • Miscibles
    • No miscibles

Solución enzimática en agua → se elimina el agua liofilizando →A esta proteína liofilizada se le añade el disolvente orgánico no miscible (cloroformo) y con lo cual, esta proteína mantenía la actividad en estas condiciones. Entonces hay que determinar cómo es la estructura 3D en este medio. La proteína tenía una estructura exactamente idéntica a la proteína en disolución acuosa, por la razón de que la proteína estaba rodeada de una capa de moléculas de agua, porque cuando se somete al vacío, se eliminan todas las moléculas de agua que están libres, esa película seca de proteína que queda en el liofilizado, queda en interacción con una pequeña película de agua. Entonces las moléculas de agua no se van o disocian de la proteína en cuanto ésta llega a tener el disolvente inorgánico. Son moléculas de agua que están inmovilizadas en la proteína.

Se tiene una proteína con la misma estructura, con la misma reacción, tiene una gran ventaja. Si queremos que la enzima funcione para dar productos muy poco solubles en agua. Si tengo la enzima en disolvente orgánico, no puede haber contaminación por microorganismos que estén en el medio que degraden la proteína. No hay que esterilizar ni mantener en un ambiente muy controlado, si se tienen que usar estos disolventes orgánicos para purificar, se puede hacer todo lo que se requiera al disolvente.

Si se analiza la sensibilidad a la temperatura, estas son más resistentes a la desactivación térmica, porque la costra de agua hace también de armazón, dificulta, reduce la flexibilidad conformacional que puede desactivar a la proteína. Depende de cada proteína, también.

En estas condiciones se ha conseguido que determinadas enzimas catalicen reacciones completamente distintas a las del medio en agua. Sin agua, no puede haber hidrólisis, entonces la tripsina forma los enlaces y no los destruye. Si ponemos un agente nucleófilo nuevo que tenga un grupo amino libre que dará como resultado una ruptura de un enlace peptídico con otro nuevo (REACCIÓN DE TRANSPEPTIDACIÓN). Se puede usar un amino de una molécula muy hidrofóbica con un amino terminal.

Para convertir la insulina porcina en humana usando disolventes orgánicos. La porcina difiere en un único aminoácido aportando el aminoácido humano del extremo carboxilo.

ENZIMAS EN MEDIOS MISCIBLES EN PRESENCIA DE AGUA
La biotecnología de enzimas se basa en la utilización de sistemas bifásicos.

Si al sistema bifásico con una disolución cloroformo:agua (cloroformo apolar inmiscible) este sistema es altamente inestable, el sistema espontáneamente evoluciona a separar totalmente las dos fases que minimiza el perímetro de contacto.

Si se añade un tercer elemento como un surfactante que es lo mismo que un agente tensioactivo, tiene una estructura anfipática. Un detergente esas moléculas van a la interfase y forman micelas. En estas condiciones esto es absolutamente estable.

Tenemos un sistema bifásico estable por un surfactante, se puede variar entonces las cantidades de estos tres elementos se puede dar un sistema estable de agua en un disolvente orgánico o uno de un disolvente orgánico en agua. Se pueden hacer muchas gotas muy pequeñas o pocas gotas muy grandes según la cantidad de agente tensoactivo. Esto es una emulsión de gotas muy pequeñas o grandes. En este sistema bifásico se puede echar la enzima. La enzima se puede llevar dentro de las gotas de agua dentro de disolvente orgánico, habrá enzimas que estarán entre la gota aguosa y el medio lipídico como las enzimas de membrana.

Este es un sistema de micelas inversas (agua en disolvente orgánico), amplía la versatilidad de la utilización de las enzimas. Si queremos que la enzima esté utilizando una catálisis preferencial en el medio apolar, se usan gotas muy pequeñas.

FACTORES QUÍMICOS QUE PUEDEN AFECTAR A LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

FUERZA IÓNICA (Ambiente iónico)

Ver cómo la fuerza iónica afecta a la Kact frente al efecto de la concentración de distintos iones (como [NaCl]) Un rango amplio en el que la Kcat sigue siendo constante hasta que se ven fenómenos de desactivación donde se ve una pérdida parcial (en orden de 1 M de NaCl). Este efecto es un efecto de una concentración salina grande, es más un efecto inespecífico por concentraciones salinas elevadas. Precipitaciones de las proteínas (salting out), suele ser por la desestabilización de la proteína en disolución y en realidad lo que se tiene es una menor concentración de enzima porque una parte de ella está precipitada. Hay que tener cuidado de no trabajar en un caso de máxima concentración, excepto en los casos en que se ve un efecto mucho más dramático de la concentración salina. Una desactivación total (línea recta vertical) en las que el incremento de la fuerza iónica inferior a 1M que produce una precipitación, se produce una pérdida de actividad total que es indicativo de que alguno de los aminoácidos con carga que tienen un papel muy importante en la catálisis. Entonces es indicativo de que ese aminoácido cargado está en el centro activo que estabiliza el estado de transición

Una carga que el sustrato no tiene y el estado de transición sí. Se está reduciendo la energía de este estado de transición, cada caloría de estabilización selectiva da bastante sobre la capacidad catalítica. Por un apantallamiento de carga. Es una evidencia directa de que hay cargas que participan en la estabilización del estado de transición.

pH
La pepsina se inactiva por encima de un pH=3.5
La tripsina tiene un perfil de pH desplazado alcalino, entre 6.5-8.5
AcColinesterasa funciona desde el pH 8.5 hasta más adelante.
Fuera de los rangos, las enzimas pierden total actividad.
La ribonucleasa pancreática tiene actividad entre 5.5 y 6.5
Modificación de las cargas de los aminoácidos, desde estar no ionizados, a totalmente.

El efecto es mucho más crítico. Apantallamiento parcial de la interacción según se aumenta la carga o ionización. La carga es aparición total, no es un efecto parcial.

Ahora además puede aparecer una carga donde no estaba, se genera una interacción desestabilizante. El efecto es menor que sobre el efecto sobre la actividad, hay que bajar o subir demasiado el pH para ver una desestabilización estructural.

Los cambios de pH al hacer cambios de protonación deben tener consecuencias mayores en la catálisis que a nivel de estructura. Tiene que ver con que en muchos casos algunos aminoácidos del centro activo lo único que hacen durante la catálisis es actuar como ácido o como base. Ceder o captar un protón y con eso, se cataliza la reacción. Para ceder el protón, debe tenerlo per sé el aminoácido, el estado de protonación del grupo dependerá del pH.

Las condiciones en las que la cadena lateral se protona o desprotona en el contexto de la proteína no debe ser la misma que cuando está libre el aminoácido. La manera en que se pliega, el entorno es único y cada aminoácido tiene su propio y específico pKa.

Los Aps en una proteína pueden tener los pKa de ionización muy diversos según la proteína.

Cuando se alcanza un pH debajo de su pKa, los grupos se protonarán y si debían estar desprotonados para tener actividad, se desactivan. Hay varios grupos necesarios en estado desprotonado en el pH óptimo entonces todos están desprotonados, cuando baje el pH debajo del pKa de uno de ellos, del que tiene el pKa más alto → desactivación progresiva de la proteína. Es un pKa o pK1 que es esencial.

Por el mismo motivo se define un pK2 o pKb que será el pKa de un grupo cuya desprotonación es de los grupos que deberían estar protonados y corresponde al aminoácido cuyo pKa es el más bajo.
Determinar los grupos responsables de esos dos pKa y pKb.
La pepsina tiene un pH óptimo entre 1.5 y 3.5 porque el pK1 es 1.5 corresponde a un Asp y el pK2 3.5 que corresponde a otro Asp. Estos aminoácidos son esenciales en el centro catalítico.

En la pepsina el pKa1=6.5 correspondiente a un Asp, mientras que el pK2 del 8.5 corresponde a un Nterm.

Hay que tener cuidado con esto, porque el pKa de His es 6.5, pero este Asp al estar en el mecanismo catalítico tiene propiedades alteradas. Por el hecho de participar en la catálisis, tienen propiedades iónicas alteradas.

Para identificar los grupos responsables de esos pKa hay que hacer otro tipo de experimentos.
Por resonancia magnética nuclear, por suma de espectros de resonancia de cada uno de los protones. Una vez identificado el origen de cada señal en el aspecto global de las proteína, ver cuándo gana o pierde un protón y se puede ver en gran rango en cada aminoácido, eso si se tienen grandes cantidades de proteína.

Esta curva es cuantitativa, considerando que el pKa es el valor del pH en el cual el grupo tiene un 50% protonado y el otro 50% desprotonado, si es esencial para la actividad, si pongo la enzima a un pH del valor del pKa, da un 50% de actividad, para una cantidad igual de enzima.

Una reducción de la activación al 50% justo cuando se alcanza el pKa.
Según la disposición de aminoácido responsables del centro catalítico. En el caso del wild type, la Ser411 (con un OH de cadena lateral) que forma un puente de hidrógeno con la cadena lateral de un Glu400 (que puede protonarse o desprotonarse) es una interacción polar y se forma una red de interacciones polares con el Glu400 y es el grupo responsable del pKa 1 (entre 6 y menor que 5).

Cuando se sustituye la Ser por una Gly da el mismo perfil de pH que la wild type, la gly no tiene cadena lateral. Lo que ocurre es que hay una molécula de agua que está formando el puente de H con el Glu400 equivalente al formado con la Ser411. Por tanto, tienen la misma conformación.

La Ala tiene un CH3 que rellena una cavidad en la que el H2O no entra (además que el metilo no es apolar). Y el Glu tiene un H menos, el entorno es un poco más hidrofóbico, la forma desprotonada del Glu es menos estable y si es menos estable, será más fácil que se protone el Glu y si se protona, pierde la carga y esa forma es más estable en un entorno más hidrofóbico. Entonces el pKa wt antes era de 5 y ahora es de 6. Hay que subir hasta 6 para arrancarle el protón y la enzima no tiene actividad hasta que el Glu pierde la carga.

Si conocemos la estructura del centro activo, y los aminoácidos responsables, se pueden alterar por mutagénesis dirigida. El perfil de pH nos está dando el perfil catalítico.

  • La actividad frente al pH se ve alterada por los grupos críticos para la catálisis
  • Puede ser porque estos grupos participan para la reacción o en una interacción para la estructura del centro activo. (El pK2 del N-terminal del aminoácido 16 -Ile- de la pepsina) porque la Ile ocupa el sitio 16 para dar el tripsinógeno y al cortarse, se genera un extremo N-terminal donde antes no lo había. Y entonces ese amino-terminal se protona y da una carga + que es la que termina de colocar a los aminoácidos del centro activo. Se habla de un aminoácido cuyo estado de protonación es esencial para la estructura del centro activo. Si una vez activa se pone a un pH superior a 8.5, la enzima se inactiva porque pasa lo que pasaba con en zimógeno, pero al revés. Entonces desaparece la carga positiva del N-terminal y se pierde la estructura. El segundo pKa es un pKa estructural y no funcional como el primero.
  • Se pueden encontrar varios perfiles, entonces si no influye en la Kcat, influirá en la KM, entonces el grupo del pK2 no participa en la catálisis, pero sí en alguna interacción con el sustrato para formar el complejo ES.

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