Enzimología 2: Esquema cinético de los procesos

Esquema cinético de los procesos enzimáticos.

Índice

Empezamos este tema con un abordaje simple y sencillo: el caso de una reacción en el que hay un único sustrato y un único producto.

A tiempo cero (0) de la reacción tenemos dos especies E y S (enzima y sustrato) en el que se forma el complejo ES, esta formación vendrá gobernada por una constante cinética denominada k1 o constante de asociación ES. Esta constante representa la probabilidad que se forme esta asociación si los elementos enzima y sustrato se encuentran. La cantidad de veces en las que se encuentren estos dos elementos viene condicionado por las concentraciones de la enzima y el sustrato [E] y [S] (representamos con corchetes el término concentración), y debido a este hecho, se trata de una reacción de segundo orden en el que el tiempo y la concentración son protagonistas: (s-1 M-1). Sin embargo, este proceso es reversible debido a que se trata de la formación de un complejo no covalente y la probabilidad de disociación se puede observar en la constante k-1. Esta constante nos muestra la probabilidad de disociación y es unimolecular ya que sólo una especie se disocia (la especie ES) y tiene una componente de primer orden (tiempo, o s-1) ya que la velocidad de cualquier reacción es el producto de la concentración de los dos reactantes multiplicado por la constante de velocidad.

Una vez producida la reacción, va a dar lugar a la formación y liberación del producto (P). Entonces se pueden suponer unas etapas en las que se forma el complejo EP (enzima-producto) para proceder a su posterior disociación. Esta etapa por lo tanto, estaría gobernada o representada por otra constante k2 o constante catalítica de interconversión del sustrato en el producto, y como hemos visto en el caso anterior, también tiene propiedad unimolecular y componente de primer orden (s-1). Paralelamente y como se ha visto antes, en este caso también se puede considerar otra constante de disociación k-2 si se asume que esta reacción es reversible, pero en términos prácticos se suele despereciar ya que se ha llegado a la concusión que el omitir dicha constante dentro de los cálculos no da a un error demasiado grande en las etapas iniciales de la reacción (cuando el tiempo transcurrido desde el inicio de los encuentros de la enzima y el sustrato no ha sido demasiado largo).

(1)   \begin{equation*}  E+S \underset{k_{-1}}{\stackrel{k_1}{\rightleftharpoons}} ES \overset{k_2}{\rightarrow}P+E \end{equation*}

 

(2)   \begin{equation*}  V=\frac{d[P]}{dt}=[ES]*k_{2} \end{equation*}

Donde V es la velocidad de la reacción
k1 es la constante de velocidad de asociación E+S
k-1 es la constante de disociación
k2 es la constante de velocidad de la formación de P+E

Una manera de analizar estos procesos consiste en variar las concentraciones de ambas especies en función del tiempo. A tiempo cero tenemos la enzima en presencia del sustrato en el mismo medio, la [S] en t = 0 es [S0]. Una vez ha empezado la reacción, la [S] va disminuyendo debido a que se va “gastando” (convirtiendo en el producto P) hasta que en tiempo t = final, la concentración de sustrato final es cero [Sf] = 0.

Por otro lado, el caso del producto P es inverso, pues S se va convirtiendo en P durante el transcurso del tiempo. Por lo tanto, [P0] = 0 y en t final, [Pf] = [S0]. A tiempo final, la concentración del producto es la misma a la que había de sustrato en el momento inicial de la reacción.

Con respecto a la enzima E, la concentración de enzima libre a tiempo inicia t = 0 es E0 (en forma de enzima libre), en el momento que el sustrato y la enzima se encuentren, se formará el complejo ES y por tanto, la concentración de enzima libre caerá a medida que aparece en forma de complejo ES. Este valor se mantendrá estable y la concentración del complejo ES [ES] llega a un estado estacionario dependiendo de las concentraciones relativas y las afinidades relativas de la enzima y el sustrato. Cuando todo el sustrato se consume para dar lugar al producto P, las moléculas de enzima vuelven a estar en forma de enzima libre y por lo tanto, [Ef] = [E0] y [ES] = 0.

La variación del complejo ES con respecto al tiempo no es homogénea y por ello podemos definir tres etapas distintas:

  • La formación del complejo ES, es una variación positiva al estarse creando el complejo desde un estado inicial en el que no existe. Fase preestacionaria: la diferencia de la concentración del complejo ES con respecto al tiempo es mayor a cero, o dicho de otra manera: d[ES]/dt > 0. Esta etapa suele tener una duración de milisegundos.
  • Fase estacionaria: cuando no se forma más complejo ES: d[ES]/dt = 0. Tiene una duración variable y depende de las concentraciones. Puede llegar a durar segundos, minutos o incluso horas. Es en esta etapa cuando se suelen medir las velocidades de reacción.
  • Fase de resolución: cuando el complejo ES va desapareciendo. d[ES]/dt < 0. Suele durar pocos milisegundos.

La ecuación se puede simplificar cuando todo sea cero o d[ES]/dt = 0

(3)   \begin{equation*}  [ES]=\frac{k_{1}[S][E_{0}]}{k_{1}[S]+k_{-1}k_{2}} \rightarrow \frac{[S][E_{0}]}{[S]+\frac{k_{-1}+k_{2}}{k_{1}}} \end{equation*}

Recordando la ecuación de la velocidad de la reacción pero más desarrollada en este caso:

(4)   \begin{equation*}  V=\frac{k_{2}[S][E_{0}]}{[S]+\frac{k_{-1}+k_{2}}{k_{1}}} \end{equation*}

(5)   \begin{equation*}  Vm={k_{2}[E_{0}]} \end{equation*}

(6)   \begin{equation*}  K_{M}=\frac{k_{-1}+k_{2}}{k_{1}} \end{equation*}

De donde se obtiene finalmente la ecuación de la velocidad inicial V0:

(7)   \begin{equation*}  V_{0}=\frac{Vm[S_{0}]}{[S_{0}]+K_{M}} \end{equation*}

O Ecuación de Michaelis-Menten.

Donde k1,k‐1,k2 son parámetros microscópicos, y KM y VM son parámetros macroscópicos.

A partir de la ecuación de Michaelis-Menten se asume que:

  • Solamente en estos momentos, S es S0 porque conocemos la concentración de sustrato inicial, es por ello que HAY QUE DETERMINAR VELOCIDAD Y CONCENTRACIONES INICIALES.
    • No hay reacción inversa, por eso se habla de velocidad inicial y no de velocidad “a secas”. Cuando no haya aún producto.
    • Por un lado, se necesita el sustrato y el producto por otro. Ya se tiene el producto y no sería correcto si se considerase que no existe en realidad.
    • Cuando se determina la velocidad de la reacción y para determinar velocidades iniciales, se necesita un tiempo prudencial para que se libere el producto suficiente y extrapolar las observaciones a tiempo cero.
    • Cuanto mayor sea t, mayor será la velocidad.
  • Debemos estar en el estado estacionario para simplificar la reacción. La velocidad máxima depende de la concentración de enzima, ya que VM = K2[E0]
  • k2 es la constante catalítica, engloba todo lo que sucede hasta el final. Es lo que también se conoce como Kcat. Se representa en segundos (s-1). También se le conoce como turnover o número de recambio y es un indicador del número de ciclos catalíticos que realiza la enzima por unidad de tiempo. Básicamente, nos indica la eficiencia de la enzima.
  • KS es la constante del sustrato o constante de afinidad. KS = k-1 / k1. Cuanto mayor sea k-1, más baja será la afinidad. KS está relacionada de manera inversa con la afinidad y por tanto, un valor de KS muy bajo representa una afinidad muy alta.
  • KM es una constante que reúne las constantes de velocidad de contribuyen a la desaparición del complejo ES en el que el denominador es el proceso que contribuye a la formación del complejo ES. Esta constante define la cantidad de complejo ES. La KM depende de la afinidad, pero no exclusivamente. Si la constante catalítica k2 es muy alta, el complejo ES se cataliza muy rápidamente y la cantidad de complejo ES será baja:

 

(8)   \begin{equation*}  K_{M} = \frac{k_{-1}+k_{2}}{k_{1}} \end{equation*}

 

Si k-1 >> k2:

(9)   \begin{equation*}  K_{M}\approx \frac{k_{-1}}{k_{1}}\approx k_{s} \end{equation*}

Es por es to que es importante no interpretar la KM como un término de afinidad (cosa que normalmente se suele asumir durante los primeros cursos de Bioquímica). Una enzima es más eficiente cuanto más alta sea Kcat y cuando más pequeño sea KM. Ecat=Kcat/KM. Cuanto más baja sea KM, más alta será la eficacia catalítica (Ecat), y cuanto más alta sea Kcat también. Esta dependencia entre V y [S] depende de la concentración de sustrato. Si [S] <<Km, entonces:

(10)   \begin{equation*}  V=\frac{K_{cat}}{K_{M}}\cdot [E][S] \end{equation*}

La velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato y por tanto, es una cinética de orden 1 ya que la velocidad depende de la variable elevada a la primera potencia.

Cuando [S]>>Km, entonces V=Kcat*[E] y no depende de [S], se trata entonces de una cinética de orden 0 porque no depende de la variable o depende de la variable elevada a la cero potencia.
En el ínterin, se tendría una cinética de orden mixto y entonces la eficacia catalítica depende tanto de Kcat como de KM.

Para ilustrarlo con un ejemplo, la catalasa tiene una KM del orden de mM, es un valor muy alto comparado con otras enzimas (cinco órdenes de magnitud de diferencia con la hexoquinasa). Pero la catalasa descompone 40 millones de moléculas de H2O2 por segundo y su Ecat es de 4×107 M‐1 s‐1. Los valores de KM no son valores al azar, la KM tiene órdenes de magnitud similares a la concentración que tendría ese sustrato en su contexto fisiológico.

Las enzimas han ajustado su KM según el orden en que se encuentra el sustrato en su concentración fisiológica y esto puede suponer una ventaja, ya que, si la KM fuera mucho más baja que la concentración de sustrato, la velocidad de la reacción no sería sensible a cambios en la concentración de dicho sustrato; con lo cual, la propia acción de la enzima no intervendría para alterar dicha concentración. Si la concentración de sustrato se encuentra en torno a la KM, la enzima respondería muy rápidamente aumentando su actividad a medida que la cantidad de sustrato aumente.

Ya que la KM debe estar en torno a la concentración de sustrato, entonces la manera de incrementar la eficacia catalítica (Ecat) es modificando la constante catalítica kcat.

¿Por qué se observan en las enzimas valores de eficacia cataítica tan similares? Esto se debe a que hay un umbral.

En función de las colisiones efectivas o encuentros exitosos entre la enzima y sustrato, la Ecat aporta información sobre qué proporción de los encuentros con el sustrato terminan en catálisis. Una Ecat infinita indicaría que el 100% de las colisiones terminan en catálisis y que lo limitante en este caso sería el coeficiente de difusión de la proteína. Este coeficiente suele tener valores en torno a 108 M‐1 s‐1, y dado que las las eficacias catalíticas son en este orden, estas enzimas catalizan la reacción a la misma velocidad con la que se encuentran con el sustrato. Podríamos aventurarnos a decir que son enzimas perfectas.

También hay una presión selectiva por hacer las enzimas lo más pequeñas posibles, junto con la posibilidad de formar uniones entre varias enzimas y obtener complejos para que el sustrato no tenga que “viajar” mucho hasta encontrarse con la siguiente enzima de la ruta.

Ir al tema anterior

Leave a Reply

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos obligatorios están marcados con *