Cromatografía

logosemanaciencia_altaLa cromatografía es una técnica de separación de moléculas ampliamente utilizada en los laboratorios. El término fue acuñado en 1906 por el botánico ruso Mikhail Tswett, donde se pueden identificar las palabras chromas (color) y graphos (escritura). Él separó los pigmentos (las clorofilas) que obtenía de sus extractos vegetales haciéndolos pasar por una columna rellena de un material sólido poroso. En la acualidad, este término se aplica a una metodología consistente en la separación de los componentes de una mezcla que se encuentren disueltos en una fase móvil y que por sus características físicoquímicas, conseguirán desplazarse a distinta velocidad a través de una fase estacionaria. De aquí podríamos decir que el principio predominante es la retención selectiva.

A continuación, haré una clasificación bastante simplificada sobre los tipos de cromatografía.

  1. Cromatografía plana: la fase estacionaria puede estar en una placa plana o en un papel. Como ejemplos están la cromatogragía en capa fina y la cromatografía en papel. Suele tener fines analíticos (para analizar cómo está compuesta la mezcla) ya que es más complicado y menos práctico recuperar los elementos separados para emplearlos en experimentos posteriores.
  2. Cromatografía en columna: la fase estacionaria está contenida dentro de una columna. En los laboratorios de Bioquímica donde he trabajado, esta ha sido la técnica de separación por excelencia y puede aplicarse de igual forma para fines analíticos y preparativos ya que las moléculas separadas se pueden recuperar con mayor facilidad para emplearlas en experimentos posteriores.
    Aquí podríamos identificar la cromatografía de gases y la cromatografía líquida.

Como he comentado antes, esta es una clasificación simple y dependiendo del criterio, podemos hacer distintas listas y clasificar las posibles combinaciones de técnicas y agruparlas en diferentes clases como el tipo de soporte, la clase de interacción, cómo es la fase estacionaria, etc.

En este apartado me concentraré en la cromatografía líquida.
Podemos separar las moléculas en función de:

  1. Su carga: si nos interesa una molécula con carga negativa, pondremos en la fase estacionaria una “resina” (un polímero de síntesis, los dextranos, las celulosas y la agarosa no son resinas) que tenga cargas negativas para que por interacción electrostática se repelan. Tras añadir la mezcla, las moléculas con carga de signo contrario quedarán más retenidas y variando la fuerza iónica (el tampón) podemos hacer que las moléculas que estaban unidas cambien de carga y se separen de la fase estacionaria formado por ese gradiente.
  2. Polaridad: si se mantiene una fase estacionaria altamente polar como puede ser una matriz que atrapa en sus intersticios muchas moléculas de agua, las moléculas que sean más afines por el agua, quedarán más retenidas que las moléculas apolares. En la cromatografía de reparto, la fase móvil suele ser un disolvente orgánico que arrastrará las moléculas a separar según su polaridad.
  3. Afinidad: la cromatografía de afinidad emplea el principio de la funcionalidad biológica, como cuando una hormona se une a un receptor, una proteína a su ligando o un antígeno al anticuerpo. Es extremadamente específica y la molécula que queremos separar del resto es la que tiene que quedarse retenida en la fase estacionaria. El asunto ahora consiste en cómo separar esa molécula de la fase estacionaria, hay diversos métodos y en ocasiones basta con cambiar la carga neta de la molécula para que se separe de su ligando.
  4. Tamaño: cromatografía de exclusión o penetrabilidad. Es la más simple, conceptualmente hablando. La fase estacionaria será un entramado normalmente compuesto por esferas de gel porosas, las moléculas se separarán según su tamaño físico y las más voluminosas prácticamente no interaccionarán con las esferas, saldrían junto con el volumen inicial aplicado; por otra parte, las moléculas de tamaño medio, parasán rodeando las esferas de gel y quedarán retardadas. Como comenté antes, siguiendo el mismo empuje, se tardará menos tiempo en atravesar una columna si se sigue una línea recta que si hay que ir rodeando esfera tras esfera. Las moléculas más pequeñas aún, entrarán en los intersticios de las esferas y todavía estarán más retardadas que las anteriores que sólo tenían que rodearlas. Al final, saldrán primero con el volumen inicial (o el volumen que ocupan los intersticios entre las esferas) las moléculas de mayor tamaño, posteriormente saldrán las de tamaño intermedio, y con el volumen total del líquido contenido en el lecho cromatográfico saldrá la molécula más pequeña.

Durante las actividades de la Semana de la Ciencia en Madrid, solemos poner un ejemplo práctico y muy vistoso sobre esta última descripción. Colocamos una mezcla de moléculas de azul de dextrano, la proteína verde fluorescente y el ferricianuro potásico. ¿Cuál saldrá con el volumen de exclusión? ¿Cuál saldrá en el volumen de elución (volumen intermedio)? ¿Cuál saldrá en el volumen total?
Para saber la respuesta, bastará con conocer el tamaño de cada una de estas moléculas y comprobarlo en la práctica.

Pistas: el azul de dextrano es un polímero de azúcares que forma cadenas largas y grandes, es de tamaño superior al ferricianuro potásico. La proteína verde fluorescente también es de mayor tamaño que el ferricianuro potásico.

Os animo a poner vuestras respuestas en la sección de comentarios… nos vemos en la Semana de la Ciencia.

Bibliografía:
J.M. García-Segura, J. G. Gavilanes, A. Martínez del Pozo, F. Montero, M. Oñaderra, F. Vivanco. Técnicas Instrumentales de Análisis en Bioquímica. 2007. Ed. Síntesis.

2 comments

    1. Correcto. La proteína verde fluorescente es de un tamaño intermedio y por ello primero saldría el azul de dextrano, seguido por la GFP y al final el ferricianuro potásico en una columna de cromatografía de exclusión molecular.

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