Bioseguridad y aspectos bioéticos en iPSCs

Nota: aportamos una visión imparcial con este tema, en ningún momento queremos mostrarnos a favor o en contra de lo que se desarrolla en esta entrada. Únicamente exponemos los aspectos que se discuten actualmente citando a los autores respectivos.

John Jairo Aguilera, Raquel Fernández de Llano, Angélica Partida-Hanon, Cristina Parra Sanjosé.

Introducción: La bioseguridad en IPSCs concierne a los riesgos a los que se exponen los trabajadores en el laboratorio y a las normas de seguridad de los diferentes niveles, lo que en inglés se conoce como biosafety. En cambio, biosecurity se entiende como todo aquello que está íntimamente relacionado con evitar las pérdidas del material con el que se trabaja, en el caso de células madre se hace especial hincapié en el control de los procesos de transformación celular para productos destinados a terapia celular.

Biosafety
Los laboratorios están obligados a desarrollar y cumplir un manual de bioseguridad que identifique los riesgos que se pueden encontrar o que se producen, y que explique las medidas que deben tomarse para poder reducir o eliminar las exposiciones a estos riesgos. El personal que allí trabaje debe conocer los riesgos que existen en su laboratorio y está obligado, asimismo, a leer y cumplir las prácticas y procedimientos requeridos. Uno de los términos más importantes es la contención, cuyo objetivo es eliminar o disminuir la exposición del personal científico que trabaja en el laboratorio, otras personas y el medio ambiente externo, a agentes peligrosos.
Dentro de la bioseguridad existen 4 niveles que combinan cada uno, unas técnicas, prácticas, equipos de seguridad e instalaciones determinadas. (CDC, 2009)

Nivel de bioseguridad 1 (BSL – 1)
Este nivel engloba trabajos en los que se utilizan agentes que no producen enfermedades en humanos adultos sanos y que en general, presentan un riesgo mínimo para el personal del laboratorio y el medio ambiente.
No suelen ser necesarios equipos de contención especiales. (CDC, 2009)
I Prácticas estándar: las mínimas de un laboratorio, por ejemplo las que podemos encontrar en un laboratorio de prácticas de una universidad. Existen unas normas de manejo seguro de los materiales tanto biológicos como físico-químicos. Los cultivos, stocks y otros materiales antes de ser desechados se descontaminan, por ejemplo en autoclave.
II Prácticas especiales: no se requiere ninguna.
III Equipos de seguridad: En general no se requieren equipos especiales. Se recomienda el uso uniformes de laboratorio, como la bata, para evitar contaminar la ropa o ensuciarla; guantes en el caso de heridas superficiales o erupciones cutáneas; y gafas en el caso de productos peligrosos que puedan salpicar la zona ocular.
IV Instalaciones: control de acceso mediante puertas, pilas para lavado de manos, superficies impermeables y resistentes a productos químicos y factores físicos como el calor.

Nivel de bioseguridad 2 (BSL – 2)
Similar al anterior, se usa para trabajos con agentes de riesgo moderado para el personal y el medio ambiente.
I Prácticas estándar: las mismas que en el caso anterior.
II Prácticas especiales: la persona encargada del laboratorio puede restringir o limitar el acceso al mismo cuando se estén realizando trabajos con agentes infecciosos (por ejemplo, a personas inmunodeprimidas). Se deben colocar señales de advertencia de riesgo biológicos en la entrada del laboratorio cuando se usen agentes etiológicos. El personal del laboratorio tiene que someterse a las inmunizaciones o análisis de los agentes con los que trabaje (por ejemplo, vacuna contra la hepatitis B). Se limita el uso de objetos punzantes o cortantes contaminados, muchos de ellos suelen ser sustituidos en la medida de lo posible por material de plástico.
III Equipos de seguridad: se usan cabinas de clase II (campanas de flujo laminar por ejemplo) u otros equipos de contención. Protecciones faciales para posibles salpicaduras o aerosoles de materiales infecciosos o peligrosos para el cuerpo. El resto de normas son las mismas que las del nivel 1.
IV Instalaciones: es posible que se requiera una ubicación del laboratorio lejos de áreas públicas. Las cabinas u otros equipos de contención deben instalarse lejos de puertas y ventanas para evitar fluctuaciones en el aire de entrada y escape de la sala.

Nivel de bioseguridad 3 (BSL – 3)
Destinado a trabajos con agentes que pueden producir una enfermedad grave o potencialmente letal a través de vía inhalatoria. Se aplica a instalaciones clínicas, de diagnóstico, investigación o enseñanza. Todos los procedimientos con materiales infecciosos se realizan dentro de cabinas u otros dispositivos de contención.
I Prácticas estándar: las mismas que en los anteriores, pero se puntualiza que los desechos infecciosos se deben descontaminar antes de sacarlos fuera de las instalaciones para desecharlos.
II Prácticas especiales: las mismas que en BSL -2. Toda la manipulación abierta de materiales infecciosos se hace en cabinas de contención.
III Equipos de seguridad: las cabinas de contención que se usan son de clase II o III.
IV Instalaciones: los laboratorios se emplazan alejados de áreas públicas. Sistemas de ventilación por conductos que cree un flujo direccional de aire para eliminar el de las zonas contaminadas.

Nivel de bioseguridad 4 (BSL – 4)
Se aplica para trabajar con agentes peligrosos que producen infecciones transmitidas por aerosoles y enfermedades mortales. También se trabajan en este nivel aquellos agentes que presentan relaciones antigénicas cercanas a los que se trabajan en BSL – 4.

I Prácticas estándar: las mismas que en los anteriores.
II Prácticas especiales: todas las actividades se realizan en las cabinas de clase III o en cabinas de clase II pero con trajes presurizados con presión positiva y de una sola pieza.
III Equipos de seguridad: cabinas de clase III y clase II con uso de trajes especiales.
IV Instalaciones: existen dos tipos, uno de ellos es el laboratorio con cabina, donde todo se realiza en cabinas de clase III; y otro en el que se requiere el uso de trajes especiales. También puede ser una combinación de ambos modelos. (CDC, 2009)

A la hora de trabajar con células y tejidos humanos y de primates se lleva a cabo en laboratorios BSL – 2. A pesar que el riesgo de infección en un laboratorio de células animales es bajo, el riesgo aumenta con el uso de células de primates y en especial de humanos.
Los peligros potenciales asociados al manejo de células y tejidos animales (sobre todo humanas) son el riesgo a exposición a agentes patógenos de la sangre, como VIH, HPV (Virus del papiloma humano), así como Mycobacterium tuberculosis, que puede ser encontrado en células del tejido pulmonar.
Otras células de primates y mamíferos también presentan riesgos, como células inmortalizadas gracias a agentes virales como SV-40.

Todo el trabajo debe realizarse en un gabinete bioseguro y todo el material debe ser descontaminado por medio de autoclave o desinfección antes de ser eliminado. Todos los empleados que trabajan con células y tejidos humanos deben estar inscriptos en el programa institucional de patógenos transmitidos por sangre y deben trabajar conforme a las políticas y guías establecidas por el plan de control de la institución.

Biosecurity
Se entiende biosecurity como todo aquello que está íntimamente relacionado con evitar las pérdidas del material con el que se trabaja, en el caso de células madre se hace especial hincapié en el control de los procesos de transformación celular para productos destinados a terapia celular.

Peligros de contaminación de los cultivos de iPSCs.
Aspectos de bioseguridad a tener en cuenta durante el cultivo de células madre:
1 Contaminación microbiana: Existen peligros de contaminación microbiana en todos los laboratorios, por lo que en el cultivo de iPSCs se usan cabinas de clase II (campanas de flujo laminar por ejemplo) u otros equipos de contención. También se utiliza protección facial para evitar contaminaciones en el cultivo por parte del trabajador.
2 Contaminación celular: La contaminación celular puede venir tanto por parte de células del mismo cultivo en diferentes fases de la manipulación (contaminación de células indiferenciadas con las ya diferenciadas con la consecuente formación de carcinomas) como de otro tipo de células que se cultiven en el mismo laboratorio. Por ellos se utiliza material estéril y los equipos de contención mencionados en el punto previo.
3 Contaminación química:
a Iones metálicos, endotoxinas y otras impurezas del agua o del suero.
b Plastificantes de las botellas de almacenamiento.
c Radicales libres generados por la fotoactivación del triptófano, rivoflavina o HEPES al ser expuestos a luz fluorescente.
d Depósitos de desinfectantes o detergentes en pipetas, instrumentos o recipientes.
e Residuos procedentes de germicidas o pesticidas usados para desinfectar incubadoras, equipamiento o laboratorio.
f Impurezas de gases usados en las incubadoras de CO2.
4 Contaminación xenogénica. (Latil et. al., 2012; García Castro, 2009)

Problemas de bioseguridad que pueden surgir con la aplicación de iPSCs en terapia génica:
1 Formación de tumores: Dependen del potencial tumorigénico. Las células no diferenciadas son tumorigénicas: si se inyectan a un animal adulto originan teratomas y teratocarcinomas. Por lo tanto, un tema de seguridad será asegurarse que en un cultivo diferenciado a partir de iPSCs no quedan estas células indiferenciadas, o bien disponer de métodos fiables de separación y purificación de las células diferenciadas de interés respecto de las iPSCs. Para ello habrá que avanzar en estudios de marcadores (al estilo de los CD de las células inmunes) para caracterizar todas las fases intermedias de cada ruta de diferenciación. Alternativamente, se puede introducir por ingeniería genética en el genoma donante un bloque de genes que permita simultáneamente la selección de las células diferenciadas y un sistema suicida que garantice la autodestrucción de las células que no se hayan diferenciado.
2 Formación de tejidos ectópicos: Otro riesgo del uso de iPSCs en terapia génica es la migración de las células desde los “andamios” y la formación de tejidos ectópicos en otras partes del organismo del paciente.
3 Reacciones inmunológicas: Los problemas actuales ligados a los a los injertos son la escasez de donantes histocompatibles, la necesidad de administrar drogas inmunosupresoras (ciclosporina, corticoides) con sus efectos secundarios (riesgo de infecciones, de cáncer, nefropatías, etc.). Lo ideal sería derivar tejido con la identidad histológica del propio paciente para hacer autotrasplantes, lo que es posible con injertos autólogos. Además en la terapia celular, también son importantes los biomateriales que se usan para implantar las células y tejidos puesto que imitan las funciones de la matriz extracelular de los tejidos, por esta razón tienen que ser compatibles para evitar rechazos o necrosis de los tejidos. Los estudios que se están llevando a cabo no solo buscan desarrollar materiales compatibles, sino que intentan aumentar la eficacia del proceso en su totalidad. Algunos ejemplos se basan en controlar la porosidad del material, otros usan factores físicos y/o químicos; también se emplean enzimas, citoquininas, factores de crecimiento y otras moléculas (Liras, 2010). Para evitar rechazos en la terapia génica se utilizan trasplantes autólogos en la medida de lo posible.
4 Funcionalidad de las células diferenciadas: Un problema de iPSCs es que puede perder la funcionalidad debido a la reindiferenciación de las células o a que su comportamiento in vivo no sea el esperado. Los bancos de células madre juegan un papel clave en la terapia génica. Los bancos conservan líneas celulares, ya sean embrionarias (del cordón umbilical o placenta) o adultas, diferenciadas o no, criocongeladas. La importancia de la conservación radica en que los cultivos de células, sobre todo adultas, deben mantenerse en el cultivo hasta su uso, esto aumenta el riesgo de contaminación o pseudodiferenciación que puede desembocar en una pérdida del material o de funcionalidad (Liras, 2010). De la misma manera para garantizar la bioseguridad en los procedimientos se deben evaluar los procesos de diferenciación ex vivo, tanto in vitro como en animales modelo. En el caso de células embrionarias humanas se deben evaluar más características para su uso clínico, tales como la tasa de crecimiento, formación de teratomas y clonogenicidad. (García-Castro, 2010)

Los protocolos de bioseguridad han de seguirse siempre para prevenir estos problemas y han de hacerse pruebas antes de la utilización en humanos. Las principales causas de contaminación de los cultivos son debidos a contactos con materiales o medios de cultivo no estériles, equivocaciones y errores humanos. Se llevan a cabo cultivos totalmente controlados en lo referente a calidad de la instalación, de los materiales, del aire, de los procedimientos, etc.

Legislación de concierne al cultivo de células madre
El Real decreto 1301/2006 establece las normas de calidad y de seguridad para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos y se aprueban las normas de coordinación y funcionamiento para su uso en humanos.
El trasplante de células y tejidos humanos es un área de la Medicina que ha experimentado un enorme crecimiento en los últimos años y está proporcionando grandes posibilidades terapéuticas para muchos pacientes.
Su creciente utilización clínica requiere la aprobación de una norma que participe de los principios de voluntariedad, anonimato entre donante y receptor, altruismo y solidaridad que caracterizan el modelo de trasplantes del Sistema Nacional de Salud y que recoja los avances técnicos y científicos producidos en esta materia, al tiempo que prevea los sistemas de control de los procesos que se suceden desde la obtención de las células y tejidos hasta su implantación, y las condiciones que deben reunir los centros y unidades de obtención y aplicación y los establecimientos de tejidos. Todo ello con el objetivo de asegurar la calidad y la seguridad de las células y tejidos utilizados que eviten la transmisión de enfermedades y faciliten su utilización terapéutica. (BOE nº270, 2006)

Bioética
Introducción
La bioética es la aplicación de la ética a las ciencias de la salud (DRAE, 2001). La ética es la rama de la filosofía que trata de la moral y de las obligaciones del hombre (DRAE, 2001). La bioética es, por tanto, la pate de la filosofía que se encarga de la moral y de las obligaciones del hombre para consigo mismo en el entorno de las ciencias de la salud, principalmente la medicina y la biología celular, que se suelen englobar en la biomedicina, donde se incluye desde el juramento Hipocrático, hasta el código de Núrenberg, el objetivo final sea obtener soluciones y alternativas sin causar daño, ya que el fin no justifica los medios (Liras, 2010).
En la actualidad, el control ético de la actividad biomédica es un tema socialmente relevante; llegando incluso a causar serios estancamientos producidos fundamentalmente desde el ámbito jurisdiccional a través del rechazo popular que usualmente viene acompañado de desconocimiento y miedo infundado (ceab, 2009).
Desde el descubrimiento de sus potenciales aplicaciones, las células madre embrionarias humanas (hESCs) han tenido que afrontar conflictos éticos promovidos por determinados grupos sociales contrarios a la utilización de embriones humanos y de las hESCs (Montoliu, 2012). La oposición a su aplicación se fundamenta principalmente en creencias socioculturales y filosóficas, tanto ontológicas como éticas.
En esta entrada, se tratarán principalmente los motivos éticos que fundamentan la oposición al uso de las células madre, tanto hESCs como células madre pluripotentes inducidas (iPSCs).

Controversia en torno al uso de hESCs
El debate sobre la ética de las investigaciones con hESCs se ha centrado principalmente en la condición moral de los embriones humanos (Devolver, 2010). Las hESCs se obtienen de dos formas distintas en humanos, principalmente:
● De embriones humanos crioconservados. Las hESCs se obtienen de la disgragación de los embriones. Es, quizás, la técnica más polémica éticamente.
● De óvulos enucleados en los que se introduce un núcleo de blastómeros. Esto implica la existencia una buena regulación de las medidas de protección de los ovocitos donados (Liras, 2010).
Es la primera de las formas de obtención de hESCs la que más suscita controversia ética, ya que para aquellas personas que piensan que los embriones nunca deberían ser sacrificado por y para la investigación científica, puede hacer que la investigación con hESCs sea considerada no ética (Devolder, 2010: Doerflinger, 1999; Moraczewski, 2002).
El mero hecho que sepamos que un embrión es un individuo de nuestra especie nos impulsa a que distingamos en él una dignidad, que le da el rango de congénere y merezca, por ello, un trato equiparable a cualquier hombre. Por esto, la investigación con hESCs da pie a dos grandes afirmaciones en contra de ella:
● El hecho que se investiguen las aplicaciones de las células madre promueve la destrucción de células madre y crea una demanda de las mismas lo que implicará a su vez más destrucción de embriones (Devolder, 2010).
● Éticamente, e implícitamente con lo anterior, se fomenta el irrespeto del embrión (Devolder, 2010), del individuo.
Además, también se debate si realmente es ético la criopreservación de células troncales del cordón umbilical, ya que los biobancos son empresas de carácter privado que únicamente prestan sus servicios a las personas que lo pueden pagar, llegando a ser un filtro discriminatorio (Liras, 2010).

Controversia en torno al uso de las iPSCs
Después de ver la controversia que rodea la investigación de las aplicaciones de las hESCs, se debe mencionar casi en paraposición a ella, las iPSCs. Las iPSCs son células con capacidades muy semejantes a las hESCs, creadas a partir de reprogramación directa por manipulación genética de células somáticas adultas.
Muchos creen que el método de obtención de iPSCs es, tras una larga búsqueda, el método ético de obtención de células pluripotentes (Devolder, 2010). Cuando S. Yamanaka, Premio Nobel en Medicina del 2012, fue galardonado con el premio Shaw de Ciencias de la Salud en el 2008 por el desarrollo de la técnica de obtención de iPSCs, afirmó que uno de los dos grandes temas que se había entablado con el uso de ESCs (y había que solucionar) era la controversia ética que sobre la manipulación de embriones humanos (Yamanaka, 2008), y, por lo que se puede ver, fue unos de los motivos que lo impulsó al desarrollo de esta técnica; que sin requerir la intervención de ningún embrión, alivia con ello la mayoría de problemas éticos que las anteriores aproximaciones experimentales en medicina regenerativa habían suscitado (Montoliu, 2012). Sin embargo, las investigaciones con iPSCs podrían suscitar preocupaciones éticas muy similares a las que rodean a las hESCs (Devolder, 2010).
La forma más eficiente de impulsar el desarrollo y perfeccionar las técnicas de las iPSCs es comparándolas con las técnicas de las hESCs, consideradas todavía como el estándar de oro (Devolder, 2010: Baker, 2009; Daley et al., 2009). Investigaciones recientes resaltan la necesidad de mejorar la potencia de diferenciación de las iPSCs y esto requiere de comparaciones con hESCs (Devolder, 2010: Hu et al., 2010). Esto implica que para hacer comparación es necesario que la investigación con hESCs continúe, es decir, que el trabajo con iPSCs requiere la existencia de investigaciones con hESCs (Devolder, 2010).

Posturas adoptables ante las hESCs y las iPSCs
Parece haber tres opciones o posicionamientos respecto al uso de las hESCs y las iPSCs (Devolder 2010):
1. Rechazar ambas, desechando el enorme potencial de las aplicaciones de ambos tipos de células.
2. Abogar por un cambio en las investigaciones de las iPSCs que no implique la necesidad de líneas de investigación con hESCs. Esta opción imprimiría una lentitud enorme en el desarrollo de las iPSCs.
3. Buscar bases principales del pensamiento que fundamenten de una forma tan irrevocable argumentos en contra del desarrollo de las hESCs, de tal forma que se rechace la investigación para el desarrollo de las iPSCs, por requerir la investigación con las primeras.
4. Rechazar (o, mejor dicho, tolerar) las afirmaciones en contra de las hESCs, dejando un amplio margen para permitir que algunas líneas de investigación de hESCs se lleven a cabo (y por tanto también la investigación iPSC). Esta postura, desde la perspectiva de un biólogo, parece ser la más correcta.

Regulación bioética de la investigación con células madre
La regulación de las investigaciones y usos potenciales que puedan dárseles a las células madre corre a cargo de comités o comisiones de evaluación éticos. Estas comisiones aseguran que las acciones que se lleven a cabo en dichas investigaciones sean lo más éticas y responsables posible; son, por tanto, una serie de entidades que controlan el avance biomédico sin desatender los derechos fundamentales de los seres humanos (ceab, 2009).
El nivel de actuación de estos comités evalúa los métodos, protocolos de investigación y aplicación de la investigación y emiten un dictamen sobre la aceptabilidad de los resultados obtenidos (ceab, 2009).
El mismo propósito albergan las convenciones internacionales que, como el Concilio Europeo en la Convención sobre los Derechos Humanos y Biomedicina, aseguran la protección de la dignidad e identidad de todos los seres humanos y garantizan a todos, sin discriminación, el respeto de su integridad y demás derechos y libertades fundamentales con respecto a las aplicaciones de la biología y la medicina (Capítulo 1, Artículo 1), además de dar a este tipo de investigación un marco ético general y legal para los países signatarios (Liras, 2010).
Es interesante recalcar que hay países a favor son Japón, India, Irán, Israel, Corea del Sur, China y Australia. Nueva Zelanda, gran parte de África (salvo por Sudáfrica) y gran parte de Latinoamérica (excepto por Brasil) tienen restricciones con respecto las investigaciones.
En Estados Unidos la división tiene similitud, teniendo a estados dando un total soporte financiero con otros completamente prohibiéndola.
En la Unión Europea, las investigaciones con hESCs son permitidas en Suecia, Finlandia, Bélgica, Grecia, Gran Bretaña, Dinamarca y Holanda mientras que es ilegal en Alemania, Austria, Irlanda, Italia y Portugal (SCRAW, 2008).

Referencias
BOE nº270 (2006) Real Decreto 1301/2006.
Ceab (2009). Controles Éticos en la actividad biomédica. Instituto Roche.
Centers for Disease Control and Prevention. (2009) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL).
Devolder, K. (2010). Complicity in stem cell research: the case of induced pluripotent stem cells. Human Reproduction 25: 2175–2180.
García-Castro, J (2010) Células madre y bioseguridad. X Semana de la Ciencia
Latil M. et al (2012). Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nature communications: http://www.nature.com/ncomms/journal/v3/n6/full/ncomms1890.html
Liras, A. (2010). Future research and therapeutic applications of human stem cells: general, regulatory, and bioethical aspects. Journal of Translational Medicine, 8:131.
Montoliu, L. (2012). Acércate a nuestros científicos. El Nobel premia la reprogramación celular. SEBBM DIVULGACIÓN.
Stem Cell Research Around the World (SCRAW), Pew Research Center. http://www.pewforum.org/Science-and-Bioethics/Stem-Cell-Research-Around-the-World.aspx
Yamanaka, S. Autobiography. Shaw Prize: http://www.shawprize.org/en/shaw.php?tmp=3&twoid=49&threeid=56&fourid=72&fiveid=16>

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