Replicación del DNA

Esquema resumen de mis anotaciones. 

La replicación del DNA es semiconservativa, cada hebra por separado se copia y cada hebra hija tiene una parental y otra nueva. Las actividades enzimáticas están implicadas en la formación de la nueva hebra. El cómo se presentan, varía a lo largo de la evolución.

1) DNA polimerasa dependiente de DNA: el DNA materno se copia en una hebra complementaria.
2) RNA primasa
3) DNA ligasa

DNA POLIMERASA:
Desde una cadena preformada de DNA que se están introduciendo nucleótidos.
El –OH en 3’ es un poderoso nucleófilo y siempre atacará fosfatos.
El otro sustrato tendría que seguir el siguiente nucleótido, pero el siguiente no entra como tal, se tiene que activar. El nucleósido monofosfato como tal no es lo suficientemente activo como para entrar. La forma activa es el dNTP (se debe formar el derivado trifosfato). (dinucleósido trifosfato)

El OH ataca el fosfato del dNTP.
Se pasa de n restos, al n+1. El Oxígeno ataca al PPP-nucleótido-N y se desprenden dos fosfatos: PPi
n restos + dNTP → nrestos + 1 + PPi
La pirofosfatasa rompe ese PPi en 2Pi (ac fosfórico). Lo hidroliza.
El que una reacción elimine el producto de otra, asegura que la reacción de polimerización siga adelante (REACCIONES ACOPLADAS). Para que no haya reacción reversa.

CARACTERÍSTICAS DE LA DNA POLIMERASA
1) Los sustratos son desoxinuclesidos trifosfato
2) Molécula cebadora.
Necesitan una cadena preformada de DNA para que les aporte el OH en 3’ (MOLÉCULA CEBADORA)
Necesitan un extremo OH en 3’.
3) Depende de Mg2+ (como son muchas cargas negativas, para no crear repulsión)
4) La dirección de polimerización es en sentido 5’ → 3’
5) Necesita un molde para meter el nucleótido complementario.

La replicación tiene que ser fiel con una tasa de error muy baja. 1 base equivocada por cada 109 bases, para asegurarse que sea tan baja, hay mecanismos de corrección de errores:

MECANISMOS DE CORRECCIÓN DE ERRORES:
1) Sólo polimeriza el siguiente nucleótido si el anterior está formando parte de la doble hélice (si el anterior está correctamente introducido).
2) Actividad de la exonucleasa 3’ → 5’ quita la base si la anterior está incorrecta mediante hidrólisis.

RNA PRIMASA
Las DNA polimerasas no pueden introducir el primer nucleótido, por eso siempre necesitan una cadena preformada.
Si tengo el DNA molde y tiene que copiar, se sintetiza un pequeño fragmento de RNA (se sigue respetando la dirección 5’ → 3’). Una vez tenga el cebador, puede introducir el DNA.
La RNA polimerasa (actividad enzimática primasa) sintetiza un cebador dependiente de DNA. Introduce más errores, no chequea y pueden introducir siempre la primera base.
Una vez introducido el cebador,  la DNA polimerasa puede continuar, luego hay que eliminar el trozo de RNA (primer) antes añadido. Por ello queda un hueco de la molécula sin sintetizar que luego se rellena con DNA. Aunque se rellene el hueco, hay un enlace covalente que no se puede formar y se necesita la DNA ligasa para ello.

Para quitar el primer, hay que hidrolizar el enlace. La actividad que lo quita es una EXONUCLEASA 5’ → 3’

• Exonucleasa 3’ → 5’ es correctora
• Exonucleasa 5’ → 3’ hidroliza el primer

DNA LIGASA:
Une los fragmentos de DNA. En el momento que se ha rellenado el hueco, se junta con la DNA ligasa.

Actividades enzimáticas:
1) Polimerásica
2) Correctora
3) Hidrolizar el primer
4) Rellenar hueco
5) Ligasa

REPLICACIÓN DEL DNA CIRCULAR.

Se abre un bucle del DNA circular. Siempre empieza en un único sitio (en eucariotas) en el gen Ori que es reconocido por proteínas que se unen ahí. La HELICASA separa las dos cadenas rompiendo los puentes de hidrógeno. Una vez abierto, se unen proteína a las hebras sencillas: PROTEÍNAS DE UNIÓN A HEBRA SENCILLA.
Una vez empezada la replicación, es casi siempre bidireccional por las dos hebras y se van sintetizando cuatro hebras nuevas. El DNA circular se iría retorciendo más por el otro lado a medida que esto sucede y entonces las TOPOISOMERASAS cortan las hebras y deshacen las vueltas para que se vayan separando las hebras parentales.

La hebra molde es 5’ → 3’
Las DNA polimerasa sintetizan de 5’ → 3’ pero como la molde está 3’ – 5’ una de las dos hebras se sintetiza a fragmentos o de forma discontinua, dando lugar a la hebra líder y hebra retardada.

La hebra retardada se sintetiza por fragmentos de Okazaki, que no incluyen el primer. Una vez sintetizada, hay que eliminar los primers y rellenar los huecos.

En la replicación normal la DNA polimerasa III es minoritaria pero es muchísimo más rápida que la I.

DNA polimerasa I
Péptido multifuncional con tres dominios:
1) Dominio polimerasa
2) Correctora (exonucleasa 3’ – 5’)
3) Exonucleasa 5’ – 3’
En cada dominio una actividad catalítica.

DNA polimerasa III
es una holoenzima, un complejo multienzimático.
Es complejísima, conjuntomuy grande de PRs distintas y actúa como un dímero.
La exonucleasa está en otra PR que es cercana, pero no en la misma.

En la horquilla de replicación, progresan bidireccionalmente. En la horquilla va el dímero avanzando (el dímero de la DNA poli III)

Modelo que explique que avanzan al mismo tiempo. En la hebra retardada, de una vuelta y entonces (hace un bucle) para que se ajuste el sentido.
La retardada va acompañada por una primasa. Que hace el primer (la primasa).

DNA polimerasa II
Parece que es capaz de polimerizar DNAs en circunstancias estresantes, como cuando se rompe el DNA, con alto índice de error, pero logran sobrevivir en circunstancias prácticamente letales. Reparación del DNA ¿SOS?

FASES DE REPLICACIÓN:
1) Iniciación
2) Elongación
3) Terminación

INICIACIÓN:
En los procariotas, el gen ori es reconocido por una serie de PRs de iniciación que acuden a ese sitio (entre ellas está la helicasa) y rápidamente se abre un bucle. N PRs de iniciación, entra la helicasa y luego las primasas y la DNA poli III.

ELONGACIÓN:
La DNA poli III sintetiza la mayor parte del DNA nuevo. Sintetiza la hebra líder y los fragmentos de okazaki. La poli I elimina el primer y va por detrás madurando el DNA nuevo que es quitar los primers y rellenar los huecos con su actividad exonucleasa. Como necesita un cebador, el –OH del fragmento de Okazaki. Y la ligasa cataliza el enláce ester que quedaba.

TERMINACIÓN:
DNA ligasa.
Poli I va rellenando, y la ligasa une.

REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS:
Las DNA polimerasas hay varias en el núcleo, una sintetiza la líder, otra la retardada, otra para reparar… hay polimerasas mitocondriales, de cloroplastos.
Correctora cerca, nucleasa que quite los primers, una polimerasa.

Como lo cromosomas son muy largos, no hay un únicos sitio de iniciación. Entonces hay varios sitios. Varias horquillas.
En la cromatina hay PRs histonas y no histonas y el DNA superenrollado, entonces antes de empezar la replicación, hay que deshacer las asociaciones de las PRs, hay que disgregarlas y fabricar para otra dotación. Una manera de controlar la replicación es modificando las histonas, si se unen o se desunen.

TELÓMEROS Y TELOMERASAS:
En el DNA circular, para rellenar el primer se cogía el fragmento de okazaki, siempre habrá un cebador. En el caso de un cromosoma lineal, cuando se quita el primer ya no hay cebador para rellenar ese hueco. En los extremos 3’ de los cromosomas lineales hay una secuencia que son los telómeros de secuencias repetidas de unos nucleótidos y el telómero se repliega sobre sí mismo y hay un cebador para rellenar ese hueco.
La enzima que forma esa secuencia es la telomerasa.
Formado por RNA y una parte PRica. Ese RNA (ribonucleoproteína) es el molde para formar el telómero, la enzima es una transcriptasa inversa. Está tomando molde RNA y sintetiza DNA. Está copiando n veces.

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