Bioquímica 4: Metodología en el estudio de las proteínas

TÉCNICAS PREPARATIVAS:

Volúmenes grandes (relativamente grandes): 5mL, 10mL
Hay que mantener mínimo el pH y la temperatura (tampón y hielo).
DE BAJA RESOLUCIÓN, pero no deben ser destructivas.

Del material biológico → → TÉCNICAS PREPARATIVAS → → → Biomolécula.

TÉCNICAS ANALÍTICAS:
Técnicas de alta resolución para estudiar la biomolécula. Muchas veces la misma técnica puede servir como preparativa y analítica dependiendo de cómo se use.
Volúmenes pequeños (microlitros), la metodología es clara. Hay que ser muy cuidadoso, de manejo muy especializada y aparatos muy delicados.
En ocasiones no importa que sean técnicas destructivas.

Técnicas:
1) Centrifugación: Preparativas y analíticas.
rpm: revoluciones por minuto, no es un parámetro que no me habla de cómo se separará. Varía el giro según el radio, no dice exactamente a qué campo centrífugo.
Nº de g: Número de veces de la aceleración de la gravedad. Esta es una fuerza centrífuga absoluta.
Hay tablas que ponen cuántas rpm y qué radio se necesita para alcanzar determinados g’s.
Coeficiente S: Svedberg, velocidad de sedimentación por unidad de campo centrífugo. S=dx/dt * 1/campo centrífugo
Cuanto mayor S tenga una partícula, más grande es (con ciertos matices.

a. Preparativas: Fraccionamiento subcelular.
i. Homogeneizar (es destructiva, genera calor)
ii. Centrifugación secuencial. Ir quitando materiales que no interesan hasta quedarse con lo que interesa.
b. Analíticas: las ultracentrífugas son muy sofisticadas, con vacío, refrigera, etc. Para calcular el peso molecular de PRs.
Los tubos tienen una forma especial. Para obtener una centrifugación limpia de la molécula y evitar rozamiento con las paredes del tubo.
Tiene un sistema óptico y un sistema de registro.
Va midiendo el avance del frente de sedimentación, despejando y sabiendo el tiempo, se puede determinar el coeficiente S.
Obtener entonces con el S, el PM
TAMBIÉN VALE COMO CRITERIO DE PUREZA.

2) Precipitación fraccionada: Elimina otras moléculas.
Añadiendo determinados compuestos en el medio, las biomoléculas pueden ir precipitando. Algo que entre en competición con las moléculas de solvatación. Las que tengan pocas moléculas de solvatación precipitarán antes.
Se colocan iones, se una sal muy soluble como el sulfato amónico. (NH4)2SO
La mioglobina es muy soluble, por eso hay que añadir más sulfato amónico.
SALTING OUT. Una vez precipitada la proteína, hay un precipitado y un sobrenadante. Entonces se centrifuga y se desecha el sobrenadante.
Ahora se tiene la proteína con sulfato amónico. Si se hace con sal, hay que hacer una diálisis, colocando la bolsa de diálisis en un medio tamponado y con hielo,  habrá que cambiar el medio constantemente porque es un movimiento de iones a favor de gradiente de concentración.

3) Cromatografía: Separación de moléculas basadas en una distribución diferencial entre dos fases. Inmiscibles entre sí, cuando una pasa a través de la otra.
Las moléculas se quedan preferentemente en una de las fases, las fases móviles y estacionarias no se pueden separar.

a. Cromatografía de reparto: Diferencias de solubilidad: la que es soluble con la fase móvil, se va. Para proteínas casi no se usa.
b. Cromatografía de adsorción (que no absorción): Diferencias de interacciones no covalentes. Fuerza de adsorción, si una se queda adsorbida, la otra irá con la móvil. Interacciones iónicas, puentes de H+.
i. Cromatografía de intercambio iónico (intercambiador catiónico y aniónico). La fase estacionaria normalmente se utiliza en columna.  Los granos de la fase estacionaria tienen cargas. (positivas o negativas) como pasa con la carboximetilcelulosa (carga negativa) o la
DEAE (dietilaminoetil) celulosa (carga positiva).
Si la molécula retenida es la que me interesa, entonces tendré que meter un ión de la misma carga para que compita con ella.
Es un intercambiador catiónico si la que queda retenida es un catión (positiva).
También se puede separar y varío el pH ya que podría perder la carga si varío el pH.
Dos formas de eluir: por gradiente de pH o introduciendo iones que compitan con las moléculas retenias.
Catiónico: intercambia cationes (la fase estacionaria es un anión).
Es también una técnica preparativa y analítica. Ya que puede obtenerse el PI.
En el punto donde haya PIs parecidos, eluirán juntos.
TÉNICA QUE SE BASA EN LA SEPARACIÓN POR PUNTO ISOELÉCRICO

c. Cromatografía de penetrabilidad (o permeabilidad en gel, exclusión molecular, de filtración en gel…): por diferencia de penetración
La fase estacionaria no está cargada. Se intenta que sea lo más neutra posible (sin carga, pocos grupos funcionales, etc.) TAMAÑO DEL PORO.
Son polímeros que forman cuadrículas: sephadex (polímeros de glucosa enrejados)
Son geles, hidrófilas, se hinchan, en medio tamponado.
La molécula grande no puede pasar por el enrejado de cada bolita, entonces va sorteando, las péquelas van recorriendo el gránulo porque se va retrasando porque pasa dentro de la bola y el enrejado.
LAS MOLÉCULAS GRANDES ELUYEN PRIMERO.
TÉCNICA ANALÍTICA Y PERPARATIVA.
Volumen de elución: el volumen de fase móvil necesario para que eluya, es inversamente proporcional al tamaño.
Puedo representar una recta donde está el log del PM frente al volumen de elución. Recta patrón con sustancias de pesos moleculares conocidos.

d. Cromatografía de afinidad: Por diferencias de afinidad biológica
Moléculas que no son separables de otras por las otras técnicas.
Propiedad de unión específica de PR y es difícil que haya solapamiento. La misma afinidad y grado de retención es difícil.
UNA GRAN PURIFICACIÓN, ALTA ESPECIFICIDAD. TÉCNICA MUY CARA.

4) Electroforesis: Técnicas basadas en el movimiento de las moléculas por un campo eléctrico. Para moléculas cargadas.
Si son moléculas pequeñas como los aminoácidos, debo saber el pH del medio para saber cómo van a migrar. Según el pH, la carga de los aminoácidos variará.
El pH idóneo es el punto medio, ya que así migrarían todas a un polo y otras a otro para ello conviene poner los puntos isoeléctricos secuencialmente de menor a mayor y buscar el punto medio.
– Depende de la carga Q (factor importante) la carga que tenga al pH en el que ocurra la electroforesis.
– Movilidad (densidad, tamaño, radio, etc.) en principio consideramos la carga.

a. PAGE-SDS: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS. Se desnaturalizan las proteínas y se cargan negativamente.
El SDS es un detergente que desnaturaliza las proteínas, con el SDS se anulan las cargas.
Todas las moléculas tienen carga negativa y distinto tamaño. Una PR grande unirá muchas moléculas de SDS, cargadas todas negativamente pero de distinto tamaño.
Se cargan en un gel con enrejado a nivel molecular, aplicando el campo eléctrico todas irán migrando y se separarán por tamaño a través del enrejado.

b. Electroenfoque o de gradiente isoeléctrico: en condiciones nativas. Por cargas.
Se prepara un gradiente de pH y se aplica corriente eléctrica, es complejo.
Cuando llega al pH igual a su PI, la PR se detiene.
Muy caro, altísima resolución.

c. Electroforesis bidimensional: Para aumentar la resolución, primero se hace un electroenfoque con las proteínas en condiciones nativas y el gel se coloca luego sobre uno de PAGE-SDS y se hace en la otra dirección.

PROTOCOLO PARA PURIFICACIÓN DE ENZIMAS:
Varias etapas. Se va aumentando el grado de purificación para sacar la máxima cantidad de proteína con la mayor pureza posible.

DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE LAS PROTEÍNAS
Análisis de la composición de aminoácidos.
Métodos de secuenciación automatizada.

DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL
Difracción de rayos X: Incidir un haz de rayos X en un cristal y se difracta. Hay que cristalizar la proteína y no siempre es fácil, además que puede variar su estructura 3D.
RMN: resonancia magnética nuclear, vale con la proteína en disolución y en su estado nativo.
Dicroísmo circular: vale también con la proteína en disolución, no aporta información a nivel atómico como lo hacen la cristalografía y la RMN.

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