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¿Qué es la RMN?

Resonancia magnética nuclear o RMN.

En el laboratorio de RMN de alto campo del CSIC nos encargamos de aplicar esta técnica para caracterizar moléculas biológicas fundamentalmente.

La biología estructural se encarga del estudio de las propiedades estructurales y dinámicas de las proteínas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas dentro de un contexto biológico.

Por RMN se determinan las posiciones de cada uno de los átomos que constituyen la molécula. Para ello, se necesita que la muestra se encuentre normalmente en disolución acuosa. De esta forma se puede estudiar su plegamiento y dinámica, lo cual es de gran interés para el desarrollo de fármacos.

Del mismo modo, la RMN en estado sólido permite la caracterización de estas macromoléculas en un contexto complementario a la aproximación anterior. Se puede estudiar de tal forma proteínas de membrana, neuroreceptores, canales iónicos, fibras amiloides, etc.

La RMN también puede aplicarse a estudios metabolómicos en la que los fluidos corporales es la muestra de mayor interés para este tipo de estudios (sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, etc). Por RMN se puede generar un perfil de estos fluidos extraídos de las muestras obtenidas para tener un perfil.

La resonancia magnética nuclear de imagen (RMI o MRI) es una técnica empleada en radiología que se aprovecha de la localización zonal del agua y tejido adiposo para elaborar un mapa 2D y 3D. El sonido característico se debe a la contracción y expansión de la bobina, que genera una vibración audible de hasta 120 dB. Hay que tener en cuenta que la RMI es en realidad RMNI o resonancia magnética NUCLEAR de imagen, pero por miedo se ha quitado la palabra nuclear del nombre en los hospitales, debido a que la gente entraba aterrada a hacerse este tipo de pruebas.

Es importante mencionar que la RMN NO ES UNA TÉCNICA QUE APORTE RADIACTIVIDAD, el término nuclear infunde un miedo sin sentido real y estricto. La técnica es nuclear porque se aprovecha de las propiedades del núcleo del átomo. Así como una célula tiene un núcleo y no lo asociamos a radiactividad, hay que erradicar la idea del término nuclear como peligroso o dañino.

Nos centraremos aquí en la RMN en disolución de proteínas y péptidos.

El fenómeno de la RMN ocurre porque los núcleos atómicos poseen una propiedad mecanocuántica denominada spin nuclear que es fijo para cada tipo de núcleo. Los núcleos con spin distinto de cero se comportan como una distribución finita de carga y por tanto, tienen un momento magnético proporcional y paralelo al espín nuclear. Esto quiere decir que se comportan como pequeños imanes.

En función del ambiente molecular que rodee los distintos núcleos, se podrá trazar un mapa en el espacio que definirá finalmente el plegamiento, la dinámica y las posibles interacciones intra o intermoleculares a escala atómica.

La RMN no es la única técnica empleada para elucidar la estructura de biomoléculas a escala atómica, la difracción de rayos X y la cryo-EM también aportan mucha información. Pero las limitaciones de cada técnica se ven solventadas por otra.

Como toda técnica de uso para caracterización biomolecular, la RMN posee ciertas ventajas y desventajas en el momento de recurrir a ella.

VENTAJAS

Una de sus principales ventajas es que se trata de una técnica per se no destructiva, eso significa que una vez finalizado el experimento, se puede recuperar el material biológico y volver a ser empleado en sucesivos experimentos.

Al estar en disolución, estamos ralizando un estudio básicamente en su estado nativo y más cercano al que se podría encontrar en un sistema vivo. Es de suma importancia en el área biomédica el poder emular experimentos lo más cercanos a lo que se encontraría in vivo.

Obtenemos información tridimensional de la molécula en su estado plegado, parcialmente plegado, o desplegado (como las proteínas intrínsecamente desplegadas) o ver distintas conformaciones y encontrar la mayoritaria en el caso de los péptidos. Todas estas posibilidades se pueden encontrar en la naturaleza y estudiarse por RMN a escala atómica.

Otra de las enormes ventajas que tenemos, es el estudio de la dinámica molecular. Las biomoléculas no son entes rígidos, la dinámica les otorga funcionalidad biológica y el ser capaces de estudiar dicha capacidad de movimiento es un gran plus a la RMN en comparación con otras técnicas.

Podemos ver también cómo afectan los cambios de temperatura, de pH, el tipo de disolvente o comparar una proteína en su estado libre o unido a su ligando haciendo titulaciones.

LIMITACIONES

Como no todo son ventajas, algunas de las limitaciones las podemos encontrar en su bajo nivel de sensibilidad y debido a ello, la técnica está actualmente limitada a determinado tamaño de moléculas, hacia alrededor de los 30kDa, el tamaño máximo de las proteínas susceptibles de ser investigadas por RMN está en torno a los 60-80 kDa para las técnicas de rutina pero estos límites pueden ir aumentando a medida que haya avances en la tecnología.

También debido a su sensibilidad, la cantidad de material de estudio necesario tiene que ser grande, en el rango de los miligramos por cada 500 microlitros y el tiempo de adquisición varía entre un día o semanas.

Esta técnica es muy costosa, no únicamente en el instrumental necesario y su mantenimiento como el tener que rellenar los espectrómetros con nitrógeno y helio líquidos, sino que las muestras para estudio pueden necesitar un marcaje isotópico (no asociemos isótopo con radiactividad, hay isótopos no radiactivos y son los que empleamos) que lo encarece muchísimo.

El personal tiene que tener una formación muy especializada en RMN, por ello en el equipo contamos con físicos, químicos y bioquímicos que trabajan sinergia. Esta técnica no es de la que los fundamentos se aprenden en un par de días y se necesitan cursos específicos de capacitación para los que empleamos estas técnicas.

Finalmente, para asignar un espectro de resonancia, hace falta dedicar mucho esfuerzo y tiempo.

MATERIAL DE PARTIDA

Para adquirir los espectros de RMN, es necesario que las muestras estén en presencia de un campo magnético. Para el estudio estructural de proteínas se requieren campos magnéticos de al menos 500 MHz o una frecuencia de precesión de 11.7 T, llegándose en la actualidad a conseguirse hasta espectrómetros de 1 GHz.

Los núcleos empleados para estudio, como he mencionado antes, tienen que tener un spin nuclear distinto a cero y contamos para ello con distintos isótopos como el carbono 13, nitrógeno 15, fósforo 31.

Marcamos isotópicamente porque la abundancia natural de estos núcleos es realmente baja, como el 13C que ronda el 1.1%, mientras que el 15N del 0.37%. En función del tamaño de la molécula a estudiar, será necesario o no el marcaje isotópico mediante el empleo de técnicas de Biología Molecular.

La magnitud del campo magnético de los espectrómetros de RMN suele expresarse como la frecuencia de resonancia del protón, siendo la sensibilidad y la dispersión de las señales mayores al aumentar el campo magnético. Cuanto mayor sea el tamaño de la biomolécula, mayor será el campo magnético mínimo requerido para su estudio estructural.

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  • S = señal
  • N = ruido (noise)
  • B0 = Campo magnético

La sensibilidad (S/N) está relacionada con el campo magnético, como podemos ver en esta ecuación en el numerador.

Los núcleos con espín diferente a cero pueden considerarse como pequeños imanes que colocados dentro de un campo magnético tienen una energía que depende de su orientación respecto al campo. Estas energías se encuentran cuantizadas. El nivel de menor energía está más poblado que el de mayor energía, la diferencia de poblaciones entre los dos niveles es muy pequeña y esto hace que la sensibilidad de la RMN sea pequeña y hagan falta muestras concentradas para la adquisición de los espectros, debido a que la señal de RMN es consecuencia de las transmisiones entre los niveles de energía.

Las transiciones entre los niveles de energía ocurren al aplicar pulsos de radiofrecuencia.

Por otra parte, una criosonda hace que R·T  en el denominador sean muy bajos y por lo tanto, la relación señal/ruido sea mayor.

ELUCIDACIÓN DE LA ESTRUCTURA

Las etapas para la determinación de las estructuras no son independientes entre sí, sino que en función de los resultados que se vayan obteniendo, puede ser necesario volver a pasos anteriores.

Es necesario tener una muestra adecuada para el estudio, optimizar las condiciones de experimentación, adquirir los espectros de resonancia y proceder al cálculo y obtención de estructuras finales.

Hay que tener en cuenta que las macromoléculas son moléculas grandes y que a medida que su peso molecular aumenta, el tiempo de correlación también lo hace y las señales del espectro serán más anchas. Es por eso que se recurre a la espectroscopía multidimensional y al etiquetado isotópico de las moléculas de estudio.

Durante la preparación de la muestra, hay que tener en cuenta el tamaño con el que trabajamos, si estamos con péptidos puede no hacer falta un etiquetado isotópico y bastar con espectros homonucleares (como un espectro bidimensional de protón o “protón-protón”). Por otro lado, en el caso de moléculas más grandes, esto no puede se una opción porque se obtendría un espectro muy difícil de analizar en el que se se ve la presencia de un gran número de señales, además del gran solapamiento de señales que caerían en el mismo sitio.

Para estos casos, es necesario recurrir a la espectroscopía multidimensional en 2D, 3D, 4D y un marcado isotópico.

En cuanto al marcaje isotópico, estamos hablando de una etapa muy costosa durante la obtención del material de estudio. Para obtener las proteínas etiquetadas en nitrógeno 15 y/o carbono 13, hace falta emplear técnicas de Biología Molecular para producir proteínas recombinantes como hacer crecer en un medio de cultivo ricos en isótopos  los organismos que sintetizarán la proteína de interés. Es un proceso caro, lento y muy difícil de conseguir.

Para el etiquetado isotópico, se puede marcar la proteína completa, alguno de los dominios, una parte de la proteína, el ligando, el receptor, ambos o incluso el DNA o RNA.

En un espectro protón-protón de grandes moléculas se ven un solapamiento de las señales. Para poder separar esas señales un espectro heteronuclear da rangos de separación mucho más amplios. Gracias a la variación de los desplazamientos químicos del 15N, se pueden separar.

Las condiciones deben ser óptimas para la adquisición de los espectros de resonancia y para ello, la muestra tiene que ser soluble, estar muy concentrada, muy bien purificada, estar correctamente plegada en la forma que se desee estudiar ya que no aplica igual para péptidos o proteínas intrínsecamente desestructuradas, también debe ser una muestra monodispersa o que no haya agregados, que no tenga partículas sólidas ni impurezas paramagnéticas y sea estable a una determinada temperatura y pH a lo largo del tiempo de adquisición de los espectros.

Se pueden variar distintos parámetros como el pH, la temperatura, los tampones, la fuerza iónica, la concentración para tener las condiciones óptimas de adquisición. Pero siempre tomando en consideración el problema biológico acerca del que se pretende obtener información, así como la estabilidad y la solubilidad de la proteína.

Se trata de encontrar las condiciones que mejor reproduzcan aquellas en que la proteína es biológicamente activa y en las que a su vez sea posible la adquisición de espectros de RMN. Por esta razón, la estructura suele determinarse en disoluciones acuosas, a temperaturas menores o iguales a 35ºC y a pH inferior a 7 ya que por encima de 7 dejan de observarse algunas señales de RMN de interés.

ADQUISICIÓN DE LOS ESPECTROS DE RESONANCIA

Las transiciones entre los niveles de energía ocurren al aplicar pulsos de radiofrecuencia.

En una muestra que contenga un gran número de núcleos con la misma frecuencia de Larmor, existirá una magnetización neta paralela al campo. Dependiendo de la duración del pulso de radiofrecuencia, el vector de magnetización girará en un ángulo distinto en el plano yz. Un pulso de 90º lleva la magnetización al eje y.

Después del pulso de 90º, la magnetización precesa en el plano xy alrededor del campo magnético situado en el eje z, generando señales de radio que decaen exponencialmente con el tiempo y dan origen a la FID (Free Induction Decay).

La transformada de Fourier de la FID pasa del dominio de los tiempos al de las frecuencias, dando lugar al espectro de RMN.

En función de la naturaleza de la biomolécula a estudiar, se decidirán distintos tipos de experimentos.

Una vez seleccionadas las condiciones de preparación de la disolución de la molécula bajo estudio, si la calidad y características del espectro 1D de protón son adecuadas, se puede proseguir con la obtención de los espectros multidimensionales requeridos para la determinación de su estructura. En caso contrario, se modifican las condiciones hasta encontrar unas apropiadas para la obtención de espectros de RMN. Mediante el examen del espectro monodimensional, se evalúa el estado de la muestra en cuanto a la presencia de impurezas, relación señal-ruido y estado nativo o desnaturalizado.

De esta forma, la información del 2D se puede resolver en la tercera dimensión.

PROCESAMIENTO DE DATOS

Cualquier determinación estructural por RMN requiere la asignación de las señales de resonancia a núcleos individuales de la molécula bajo estudio. Existen estrategias de asignación bien establecidas que constan de distintas etapas.

Esta etapa podría estar ayudada por sistemas automáticos informáticos, pero no son del todo perfectos y siempre necesitan de la intervención humana.

La asignación de un espectro de resonancia consiste en la identificación de las señales de RMN correspondientes a sistemas de spin independientes para cada aminoácido y la asignación secuencial de los residuos antes identificados. Dicho en otras palabras; se trata de identificar cada protón para cada aminoácido, ponerle su nombre y posteriormente asignarle el número que le corresponde en secuencia hasta completar la proteína o péptido.

De momento nos centraremos en un ejemplo para un sistema pequeño en el que tenemos espectros homonucleares (dos dimensiones de protón) COSY, TOCSY y NOESY.

Con los espectros COSY restringimos las conectividades a tres enlaces porque no disponemos de la resolución suficiente para ir más lejos. En los espectros COSY aparecen señales de correlación entre protones acoplados escalarmente, lo que permite identificar las señales NH-Halfa, Halfa-Hbeta de un mismo aminoácido. Une entonces el protón amídico con el protón alfa, el protón alfa con el beta, el beta con el gamma, y así sucesivamente.

De esta forma, continuamos con los experimentos TOCSY en que que vemos enlaces situados en el mismo sistema de spin o que corresponden al mismo aminoácido. Así, encontramos señales de correlación entre todos los protones pertenecientes a un mismo sistema de espín. La señal del protón amídico del aminoácido 1 da con la del protón alfa del mismo, con el protón beta, con el gamma, con el épsilon… y así hasta completar ese aminoácido en concreto.

Finalmente, los espectros NOESY nos dan información a largo alcance, de alrededor 5A o menos. La conexión secuencial de los sistemas de spin asignados se lleva a cabo a partir de los NOE entre protones de residuos contiguos en la secuencia observados en un 2D o 3D NOESY. La intensidad, el número y tipo de las correlaciones NOE secuenciales que se observan en cada segmento de la cadena dependen de la estructura secundaria, pero siempre habrá una distancia menor a 3A en residuos contiguos que da lugar a un efecto NOE intenso. Los espectros NOESY nos tan por lo tanto, información espacial.

El efecto nuclear Overhouser es el parámetro de RMN más importante desde el punto de vista estructural. Por el efecto NOE se transfiere magnetización entre núcleos próximos en el espacio, dependiendo la eficacia de esta transferencia y, por tanto, la intensidad del efecto NOE observado. Esta dependencia hace que el efecto NOE entre dos protones sea observable si estos se encuentran a una distancia inferior a 4,5-5 A, puesto que por encima de esta distancia, la intensidad NOE se hace tan pequeña que no se detecta experimentalmente. La observación de señal NOE entre protones alejados en la secuencia de la proteína indica que estos se encuentran espacialmente próximos, lo que restringe en gran medida el espacio conformacional de la proteína. Para el cálculo de las estructuras tridimensionales, la intensidad de los NOE se traduce en cotas superiores para las distancias entre pares de protones.

CÁLCULO DE LA ESTRUCTURA DE RMN

Se basa en convertir la información de las intensidades de señales y valores de desplazamientos químicos en restricciones de distancia y valores angulares.

El cálculo de una estructura consiste en encontrar el conjunto de estructuras o confórmeros cuyas coordenadas atómicas satisfagan todas las restricciones experimentales, de distancia, angulares y de orientación, proporcionadas por los parámetros de RMN. El método de cálculo debe ser capaz de ajustar todas las restricciones experimentales y de explorar adecuadamente el espacio conformacional.

Los algoritmos de cálculo empleados son métodos de geometría de distancias que consisten en la minimización de una función blanco variable operando generalmente en el espacio de ángulos de torsión. La función blanco es cero si se cumplen todas las restricciones experimentales.

Tras n iteraciones, se pueden añadir o generar restricciones adicionales hasta que se procede al refinamiento para obtener los confórmeros finales.

Para que la estructura resultante sea válida, el número y la magnitud de las denominadas violaciones de las restricciones, debe ser mínimo. El mapa de Ramachandran también se emplea para la validación de estructuras obtenidas.

Por RMN se obtiene un conjunto de estructuras, la estructura calculada (o los confórmeros) se representa como la superposición de entre las 10 y 20 estructuras que mejor satisfacen las restricciones experimentales. La convergencia de los datos experimentales a una única estructura se mide mediante la desviación cuadrática media entre los átomos de las estructuras o RMSD. La convergencia de los datos experimentales a una única estructura se mide por el valor RMSD.

Las estructuras calculadas pueden representar regiones muy bien definidas y otras desordenadas, los parámetros dinámicos de RMN permiten comprobar si esta falta de orden refleja la existencia de una región muy flexible en la estructura de la proteína.

CONTEXTO BIOLÓGICO

Como estamos en un contexto biológico, nos interesa también estudiar las proteínas en un ambiente similar al de las membranas. Lo más parecido a ellas que nos permite su estudio por RMN en disolución es el empleo de micelas de detergente como el DPC o el SDS.

El DPC y el SDS se pueden deuterar por completo, lo cual nos permite ver analizar el espectro y la conformación de la proteína en su presencia pero sin que las señales de la micela se superpongan con las de la molécula de estudio.

Una vez obtenidos los datos, se procede a hacer el mismo espectro con las micelas con la mitad de la población deuterada para poder ser capaces de ver las posibles señales NOE entre micela y residuos.

Una vez asignadas las señales de RMN de una proteína y sin necesidad de una determinación estructural completa, la RMN permite el cartografiado de los aminoácidos implicados en la unión a un ligando. Para ello, se comparan espectros del mismo tipo de la proteína libre y en el complejo.

La transferencia del efecto NOE entre dos protones en una molécula ligada a otra ocurre mediante intercambio químico entre las formas libre y ligada de la molécula. Si se consideran que los protones están alejados, no habría lugar a un efecto NOE observable.

Del mismo modo que si hay interacción, se pueden ver diferencias significativas en los desplazamientos químicos. El hecho que no se observen puede ser indicio que no hay interacción.

DINÁMICA

Las proteínas no son rígidas, para tener su funcionalidad biológica hace falta que actúen con cierta flexibilidad. Dicha flexibilidad les otorga la capacidad de reconocer ligandos y adaptarse a ellos o de realizar funciones enzimáticas.

Por RMN se puede estudiar los grados y las regiones de mayor flexibilidad, lo cual correctamente analizado puede ser indicio de la presencia de dinámica. Al obtener distintos confórmeros por RMN, podemos observar qué zonas se mantienen más estables en el espacio-tiempo y por tanto, los valores de RMSD serán inferiores mientras que las zonas de mayor movimiento presentarán valores de RMSD mayores.

VÍDEOS EXPLICATIVOS

Bioquímica 4: Metodología en el estudio de las proteínas

TÉCNICAS PREPARATIVAS:

Volúmenes grandes (relativamente grandes): 5mL, 10mL
Hay que mantener mínimo el pH y la temperatura (tampón y hielo).
DE BAJA RESOLUCIÓN, pero no deben ser destructivas.

Del material biológico → → TÉCNICAS PREPARATIVAS → → → Biomolécula.

TÉCNICAS ANALÍTICAS:
Técnicas de alta resolución para estudiar la biomolécula. Muchas veces la misma técnica puede servir como preparativa y analítica dependiendo de cómo se use.
Volúmenes pequeños (microlitros), la metodología es clara. Hay que ser muy cuidadoso, de manejo muy especializada y aparatos muy delicados.
En ocasiones no importa que sean técnicas destructivas.

Técnicas:
1) Centrifugación: Preparativas y analíticas.
rpm: revoluciones por minuto, no es un parámetro que no me habla de cómo se separará. Varía el giro según el radio, no dice exactamente a qué campo centrífugo.
Nº de g: Número de veces de la aceleración de la gravedad. Esta es una fuerza centrífuga absoluta.
Hay tablas que ponen cuántas rpm y qué radio se necesita para alcanzar determinados g’s.
Coeficiente S: Svedberg, velocidad de sedimentación por unidad de campo centrífugo. S=dx/dt * 1/campo centrífugo
Cuanto mayor S tenga una partícula, más grande es (con ciertos matices.

a. Preparativas: Fraccionamiento subcelular.
i. Homogeneizar (es destructiva, genera calor)
ii. Centrifugación secuencial. Ir quitando materiales que no interesan hasta quedarse con lo que interesa.
b. Analíticas: las ultracentrífugas son muy sofisticadas, con vacío, refrigera, etc. Para calcular el peso molecular de PRs.
Los tubos tienen una forma especial. Para obtener una centrifugación limpia de la molécula y evitar rozamiento con las paredes del tubo.
Tiene un sistema óptico y un sistema de registro.
Va midiendo el avance del frente de sedimentación, despejando y sabiendo el tiempo, se puede determinar el coeficiente S.
Obtener entonces con el S, el PM
TAMBIÉN VALE COMO CRITERIO DE PUREZA.

2) Precipitación fraccionada: Elimina otras moléculas.
Añadiendo determinados compuestos en el medio, las biomoléculas pueden ir precipitando. Algo que entre en competición con las moléculas de solvatación. Las que tengan pocas moléculas de solvatación precipitarán antes.
Se colocan iones, se una sal muy soluble como el sulfato amónico. (NH4)2SO
La mioglobina es muy soluble, por eso hay que añadir más sulfato amónico.
SALTING OUT. Una vez precipitada la proteína, hay un precipitado y un sobrenadante. Entonces se centrifuga y se desecha el sobrenadante.
Ahora se tiene la proteína con sulfato amónico. Si se hace con sal, hay que hacer una diálisis, colocando la bolsa de diálisis en un medio tamponado y con hielo,  habrá que cambiar el medio constantemente porque es un movimiento de iones a favor de gradiente de concentración.

3) Cromatografía: Separación de moléculas basadas en una distribución diferencial entre dos fases. Inmiscibles entre sí, cuando una pasa a través de la otra.
Las moléculas se quedan preferentemente en una de las fases, las fases móviles y estacionarias no se pueden separar.

a. Cromatografía de reparto: Diferencias de solubilidad: la que es soluble con la fase móvil, se va. Para proteínas casi no se usa.
b. Cromatografía de adsorción (que no absorción): Diferencias de interacciones no covalentes. Fuerza de adsorción, si una se queda adsorbida, la otra irá con la móvil. Interacciones iónicas, puentes de H+.
i. Cromatografía de intercambio iónico (intercambiador catiónico y aniónico). La fase estacionaria normalmente se utiliza en columna.  Los granos de la fase estacionaria tienen cargas. (positivas o negativas) como pasa con la carboximetilcelulosa (carga negativa) o la
DEAE (dietilaminoetil) celulosa (carga positiva).
Si la molécula retenida es la que me interesa, entonces tendré que meter un ión de la misma carga para que compita con ella.
Es un intercambiador catiónico si la que queda retenida es un catión (positiva).
También se puede separar y varío el pH ya que podría perder la carga si varío el pH.
Dos formas de eluir: por gradiente de pH o introduciendo iones que compitan con las moléculas retenias.
Catiónico: intercambia cationes (la fase estacionaria es un anión).
Es también una técnica preparativa y analítica. Ya que puede obtenerse el PI.
En el punto donde haya PIs parecidos, eluirán juntos.
TÉNICA QUE SE BASA EN LA SEPARACIÓN POR PUNTO ISOELÉCRICO

c. Cromatografía de penetrabilidad (o permeabilidad en gel, exclusión molecular, de filtración en gel…): por diferencia de penetración
La fase estacionaria no está cargada. Se intenta que sea lo más neutra posible (sin carga, pocos grupos funcionales, etc.) TAMAÑO DEL PORO.
Son polímeros que forman cuadrículas: sephadex (polímeros de glucosa enrejados)
Son geles, hidrófilas, se hinchan, en medio tamponado.
La molécula grande no puede pasar por el enrejado de cada bolita, entonces va sorteando, las péquelas van recorriendo el gránulo porque se va retrasando porque pasa dentro de la bola y el enrejado.
LAS MOLÉCULAS GRANDES ELUYEN PRIMERO.
TÉCNICA ANALÍTICA Y PERPARATIVA.
Volumen de elución: el volumen de fase móvil necesario para que eluya, es inversamente proporcional al tamaño.
Puedo representar una recta donde está el log del PM frente al volumen de elución. Recta patrón con sustancias de pesos moleculares conocidos.

d. Cromatografía de afinidad: Por diferencias de afinidad biológica
Moléculas que no son separables de otras por las otras técnicas.
Propiedad de unión específica de PR y es difícil que haya solapamiento. La misma afinidad y grado de retención es difícil.
UNA GRAN PURIFICACIÓN, ALTA ESPECIFICIDAD. TÉCNICA MUY CARA.

4) Electroforesis: Técnicas basadas en el movimiento de las moléculas por un campo eléctrico. Para moléculas cargadas.
Si son moléculas pequeñas como los aminoácidos, debo saber el pH del medio para saber cómo van a migrar. Según el pH, la carga de los aminoácidos variará.
El pH idóneo es el punto medio, ya que así migrarían todas a un polo y otras a otro para ello conviene poner los puntos isoeléctricos secuencialmente de menor a mayor y buscar el punto medio.
– Depende de la carga Q (factor importante) la carga que tenga al pH en el que ocurra la electroforesis.
– Movilidad (densidad, tamaño, radio, etc.) en principio consideramos la carga.

a. PAGE-SDS: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS. Se desnaturalizan las proteínas y se cargan negativamente.
El SDS es un detergente que desnaturaliza las proteínas, con el SDS se anulan las cargas.
Todas las moléculas tienen carga negativa y distinto tamaño. Una PR grande unirá muchas moléculas de SDS, cargadas todas negativamente pero de distinto tamaño.
Se cargan en un gel con enrejado a nivel molecular, aplicando el campo eléctrico todas irán migrando y se separarán por tamaño a través del enrejado.

b. Electroenfoque o de gradiente isoeléctrico: en condiciones nativas. Por cargas.
Se prepara un gradiente de pH y se aplica corriente eléctrica, es complejo.
Cuando llega al pH igual a su PI, la PR se detiene.
Muy caro, altísima resolución.

c. Electroforesis bidimensional: Para aumentar la resolución, primero se hace un electroenfoque con las proteínas en condiciones nativas y el gel se coloca luego sobre uno de PAGE-SDS y se hace en la otra dirección.

PROTOCOLO PARA PURIFICACIÓN DE ENZIMAS:
Varias etapas. Se va aumentando el grado de purificación para sacar la máxima cantidad de proteína con la mayor pureza posible.

DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE LAS PROTEÍNAS
Análisis de la composición de aminoácidos.
Métodos de secuenciación automatizada.

DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL
Difracción de rayos X: Incidir un haz de rayos X en un cristal y se difracta. Hay que cristalizar la proteína y no siempre es fácil, además que puede variar su estructura 3D.
RMN: resonancia magnética nuclear, vale con la proteína en disolución y en su estado nativo.
Dicroísmo circular: vale también con la proteína en disolución, no aporta información a nivel atómico como lo hacen la cristalografía y la RMN.

Introducción a la RMN (NMR)

RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

Los procesos celulares de los organismos superiores se ven regulados por moléculas que actúan conjuntamente en forma de grandes complejos moleculares en los que las interacciones juegan un papel fundamental. El conjunto de estas redes de interacción se conoce como interactoma. A medida que el organismo se vuelve más complejo, el interactoma también lo hace y cualquier alteración del mismo puede desencadenar patologías graves. Por ello, uno de los desafíos actuales en el área de la biología y la biomedicina es la caracterización de estos complejos a nivel atómico y energético y la descripción de su sincronización funcional. Este conocimiento puede llevar al desarrollo de nuevos métodos diagnósticos o terapias específicas.

Estructura de la α-Sarcina, obtenida mediante RMN. Perez-Canadillas, J.M., Santoro, J., Campos-Olivas, R., Lacadena, J., Martinez del Pozo, A., Gavilanes, J.G., Rico, M., Bruix, M. SOLUTION STRUCTURE OF THE CYTOTOXIC RIBONUCLEASE ALPHA-SARCIN (2000) J.Mol.Biol. 299: 1061-1073

El estudio de los componentes individuales o asociados de estas redes de interacción (proteínas, DNA, RNA, lípidos, carbohidratos, metabolitos) puede llegar a ser muy complicado. La complejidad de cada una de estas moléculas impide por una parte una predicción teórica de su plegamiento a partir de la secuencia, y por otra la elucidación de las posibles interacciones en las que puede implicarse en un sistema vivo. Por ello, es imprescindible una aproximación experimental para el estudio de estas relaciones multicomponente.

A lo largo de los años, los paradigmas en el estudio de las interacciones entre biomoléculas han ido cambiando. Inicialmente se asumía el modelo de interacción entre cuerpos rígidos en el que el reconocimiento molecular depende de la geometría de los sitios de unión. Posteriormente, se introdujeron los posibles cambios conformacionales que deben permitir el establecimiento de interacciones. Más recientemente, han tomado protagonismo las interacciones que implican dominios y proteínas intrínsecamente desordenadas (IDDs e IPDs). La importancia de estos sistemas deriva de la elevada abundancia en organismos superiores, de su papel como reguladores y de su implicación en diversas enfermedades. Sin embargo, a diferencia de los sistemas globulares, sus estructuras, funciones y modos de asociación siguen siendo poco conocidos y representan una barrera a superar para el diseño óptimo de nuevos fármacos o nuevas terapias.

La RMN es una herramienta estructural muy potente y la única que permite el estudio de las interacciones moleculares en disolución con resolución atómica, especialmente las interacciones débiles que son las fisiológicamente más relevantes. Además, también conduce a la información estructural y dinámica de los complejos, permite hacer un análisis termodinámico y conocer las cinéticas de asociación y disociación en su estado nativo (a diferencia de la cristalografía). Es representativo de la condiciones in vivo y no es una técnica destructiva.

Los núcleos atómicos poseen una propiedad mecanocuántica denominada spin (I) y es característico para cada tipo de núcleo. Los valores I pueden ser 0, 1/2, 1,…,n. Si el valor I es distinto a cero, entonces tendrá una diferencia en la distribución de la carga y tendrán un momento magnético nuclear que interaccionará con el campo magnético (B0) al que se vea sometido(el 12C no da espectro RMN y el 14N da efecto cuadrupolar). El efecto RMN se produce cuando dicho núcleo se somete a B0 y se irradia con una radiofrecuencia.

Los spines nucleares tienen una orientación determinada en equilibrio, al irradiarlos, salen de dicho estado, se desplazan del plano y se mide esta respuesta. Se interpreta la intensidad en función del tiempo aplicando métodos matemáticos como la transformada de Fourier.

Para conseguir ese campo magnético tan potente, hace falta un aparataje sumamente complejo y caro de mantener. Dentro del aparato de RMN, una serie de imanes actuarán como superconductores y para ello hace falta que se encuentren próximos al cero absoluto (0 K o -273 ºC), de momento nos hemos acercado a esa temperatura empleando helio líquido, que alcanza una temperatura inferior a 4 K o unos 269 ºC bajo cero.

Obtención de la estructura

A través de las señales NOE (Nuclear Overhauser Effect): se trata de un efecto dipolar que se produce entre dos núcleos diferentes cuando están cercanos en el espacio a menos de 5 Å aproximadamente. Contiene información estructural al ser información de distancia; cuanto mayor sea el efecto, más cercanos se encontrarán los protones entre sí.

Los valores de estas distancias son de especial interés, ya que a través de programas informáticos se puede obtener una estructura. Es como decir “Pedro está a 1 m de Pablo, Pablo a su vez está a 2 m de José y José está a 3.5 m de Pedro” se esta forma podemos formar la estructura “triángulo” entre estas tres personas.