Enzimología 1: Concepto de enzima y actividad enzimática.

En primer lugar hay que establecer la coordenada de reacción: En un sistema en que se dé una reacción, la evolución del sistema en el tiempo va desde el estado inicial hasta que el sustrato se convierte en producto. Se puede usar en término de cualquier variable, como la energía libre.
En el estado inicial, la energía libre del sistema es la energía libre del sustrato y la energía libre del sistema al final, es la del producto. Se puede definir a ΔG como la ENERGÍA LIBRE, si es negativo es porque la energía libre del producto es inferior a la del sustrato =-ΔG, es un proceso termodinámicamente favorable y se ha liberado energía. Si ΔG fuera positivo, habría que aportar esa energía libre al sistema para que el sustrato pueda transformarse en producto.

La energía libre desde el punto de vista termodinámico, si es desfavorable o no y cuánto.
En una reacción ΔG<0, el sustrato no se convierte espontáneamente en el producto porque el sustrato debe pasar por un estado de sustrato activado (debe pasar por un estado de transición) que es muy inestable, para que el sustrato se transforme en el producto debe pasar por un estado de transición y necesita una energía de activación (Ea) para que salte a ese estado. Hay que iniciar la reacción, esa Ea en muchos casos hay que aportarla desde fuera, en forma de calor, agitación, etc.

En cualquier reacción química hay que tener varios parámetros: ΔG (informa de la constante de equilibrio, de la favorabilidad termodinámica) y la Ea. En muchos casos la Ea debe ser del orden de la temperatura en que el sistema se encuentra. Si se da a temperatura baja, es porque la Ea tiene una barrera más baja.

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Cinética enzimática. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

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Bioquímica 5: enzimas, funcionalidad de las proteínas.

Una versión avanzada de este tema se puede leer en el apartado Enzimología.

En el tema anterior, se habló sobre las características del plegamiento proteico. Cuestión de vital importancia que otorga la funcionalidad a las proteínas.

Como hemos visto en temas anteriores, las proteínas pueden clasificarse de diversas formas y otro criterio es clasificarlas como proteínas simples, compuestas por una única cadena polipeptídica o proteínas conjugadas que tienen una parte proteica y otra no proteica. Si ese conjugado es del tipo proteico, se le llamaría apoproteína; de lo contrario, se trataría de cofactores que al unirse a la proteína, forman la entidad biológica funcional.

Muchas proteínas necesitan un ligando (una molécula unida a ellas) para poder funcionar. Las enzimas son proteínas con función catalítica, aunque también existen RNAs que al desempeñar funciones catalíticas se denominan ribozimas.

Una enzima se unirá a su sustrato (S) para dar un producto (P), formando intermediariamente los complejos ES (enzima-sustrato) y EP (enzima-producto), siguiendo una relación tal que: E+S libres → ES→ EP→ E+P libres.
Las enzimas variarán la velocidad de las reacciones al influir en su cinética, pero no en su naturaleza termodinámica. Para acelerar la reacción, deben adquirir un estado de máxima inestabilidad denominado estado de transición (transition state‡) para posteriormente evolucionar a un estado más estable. Esto ocurre mediante un reajuste electrónico y la cantidad de energía necesaria para llegar al estado de transición se denomina energía de activación ΔG. La velocidad de la reacción también dependerá del número de colisiones efectivas entre las moléculas E y S (se puede aumentar el número de colisiones  modificando las concentraciones de enzima y sustrato; también al subir la temperatura, aumentará la energía cinética de E y S y por tanto, las colisiones); cuanto más estable sea el estado de transición, las colisiones tendrán mayor efectividad y la reacción será más veloz. A menor diferencia de energía de activación, mayor velocidad.

Tema5-enzimas
Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

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Echinopsis en flor

Se trata de un género de cactácea cuyas espectaculares flores se abren durante la noche y florecen sólo un día. Me es imposible no compartir este vídeo sin darle el crédito a Greg Krehel por sus impresionantes imágenes.

Freaky Flowers: Echinopsis Cacti in Bloom from EchinopsisFreak on Vimeo.

A montage of a dozen types of Echinopsis cactus flowers blooming. And wilting. And just generally showing off their mind-blowing colors. My favorite cactus flowerings from the 2014 blooming season.
Echinopsis cactus flowers bloom overnight and the flowers last for only a day. Actually, the flowers are at their peak beauty for an hour or two at the most. That’s what turned me from a cactus enthusiast into a cactus photographer … the desire to try to preserve some aspect of their freaky beauty. Prior to becoming an Echinopsis addict a few years back, I had never owned a DSLR or image/video editing software.
The cacti shown in this video come from my collection. The evening when it looks like a plant’s flowers are about to bloom, I bring it indoors to image. Most of the clips in this montage show approximately 8 hours of change as the flowers open and bloom. A little more than halfway through the montage, there’s a series of three clips showing different views of a 24-hour period in the life of a yellow-flowered ‘Daydream’ plant. Six flowers that opened the night before I started filming wilt to nothingness and another 4 flowers grow dramatically and then open. This series of ‘Daydream’ clips is followed by another three showing other types of flowers wilting. These additional wilting clips are also taken over a daylong period.
The question I’m asked most often about my cactus flower still images and timelapses is whether I’ve “Photoshopped” them, that is, have I used editing software to juice things up and create the flowers’ intense colors. I do, of course, use Photoshop and Lightroom and other editing software. But not in the way most suspect. Rather than using these tools to overstate reality, I actually use them to reduce the intensity of the colors my camera captures. I have reduced the color saturation in every timelapse clip in this video by a minimum of 10% and some (‘Yes’, ‘Cabaret’ and ‘Antimatter’) by 30% or more in order to have something that wasn’t just completely blown out.
I hope you enjoy “Freaky Flowers” and invite you to contact me via my Vimeo account and/or visit echinopsisfreak.com where you’ll learn more than you ever wanted to know about these cacti and also be able to reach me via a contact form should you wish.
The 2015 blooming season is just about to start now that April approaches and I hope to be posting new timelapses soon here at Vimeo.
Best! Greg
Video: Greg Krehel. Sound: “Chin Swee Sunset” with the permission of the artists O$P$ (Owe Money Pay Money) … SoSolid Records

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Cromatografía

logosemanaciencia_altaLa cromatografía es una técnica de separación de moléculas ampliamente utilizada en los laboratorios. El término fue acuñado en 1906 por el botánico ruso Mikhail Tswett, donde se pueden identificar las palabras chromas (color) y graphos (escritura). Él separó los pigmentos (las clorofilas) que obtenía de sus extractos vegetales haciéndolos pasar por una columna rellena de un material sólido poroso. En la acualidad, este término se aplica a una metodología consistente en la separación de los componentes de una mezcla que se encuentren disueltos en una fase móvil y que por sus características físicoquímicas, conseguirán desplazarse a distinta velocidad a través de una fase estacionaria. De aquí podríamos decir que el principio predominante es la retención selectiva.

A continuación, haré una clasificación bastante simplificada sobre los tipos de cromatografía.

  1. Cromatografía plana: la fase estacionaria puede estar en una placa plana o en un papel. Como ejemplos están la cromatogragía en capa fina y la cromatografía en papel. Suele tener fines analíticos (para analizar cómo está compuesta la mezcla) ya que es más complicado y menos práctico recuperar los elementos separados para emplearlos en experimentos posteriores.
  2. Cromatografía en columna: la fase estacionaria está contenida dentro de una columna. En los laboratorios de Bioquímica donde he trabajado, esta ha sido la técnica de separación por excelencia y puede aplicarse de igual forma para fines analíticos y preparativos ya que las moléculas separadas se pueden recuperar con mayor facilidad para emplearlas en experimentos posteriores.
    Aquí podríamos identificar la cromatografía de gases y la cromatografía líquida.

Como he comentado antes, esta es una clasificación simple y dependiendo del criterio, podemos hacer distintas listas y clasificar las posibles combinaciones de técnicas y agruparlas en diferentes clases como el tipo de soporte, la clase de interacción, cómo es la fase estacionaria, etc.

En este apartado me concentraré en la cromatografía líquida.
Podemos separar las moléculas en función de:

  1. Su carga: si nos interesa una molécula con carga negativa, pondremos en la fase estacionaria una “resina” (un polímero de síntesis, los dextranos, las celulosas y la agarosa no son resinas) que tenga cargas negativas para que por interacción electrostática se repelan. Tras añadir la mezcla, las moléculas con carga de signo contrario quedarán más retenidas y variando la fuerza iónica (el tampón) podemos hacer que las moléculas que estaban unidas cambien de carga y se separen de la fase estacionaria formado por ese gradiente.
  2. Polaridad: si se mantiene una fase estacionaria altamente polar como puede ser una matriz que atrapa en sus intersticios muchas moléculas de agua, las moléculas que sean más afines por el agua, quedarán más retenidas que las moléculas apolares. En la cromatografía de reparto, la fase móvil suele ser un disolvente orgánico que arrastrará las moléculas a separar según su polaridad.
  3. Afinidad: la cromatografía de afinidad emplea el principio de la funcionalidad biológica, como cuando una hormona se une a un receptor, una proteína a su ligando o un antígeno al anticuerpo. Es extremadamente específica y la molécula que queremos separar del resto es la que tiene que quedarse retenida en la fase estacionaria. El asunto ahora consiste en cómo separar esa molécula de la fase estacionaria, hay diversos métodos y en ocasiones basta con cambiar la carga neta de la molécula para que se separe de su ligando.
  4. Tamaño: cromatografía de exclusión o penetrabilidad. Es la más simple, conceptualmente hablando. La fase estacionaria será un entramado normalmente compuesto por esferas de gel porosas, las moléculas se separarán según su tamaño físico y las más voluminosas prácticamente no interaccionarán con las esferas, saldrían junto con el volumen inicial aplicado; por otra parte, las moléculas de tamaño medio, parasán rodeando las esferas de gel y quedarán retardadas. Como comenté antes, siguiendo el mismo empuje, se tardará menos tiempo en atravesar una columna si se sigue una línea recta que si hay que ir rodeando esfera tras esfera. Las moléculas más pequeñas aún, entrarán en los intersticios de las esferas y todavía estarán más retardadas que las anteriores que sólo tenían que rodearlas. Al final, saldrán primero con el volumen inicial (o el volumen que ocupan los intersticios entre las esferas) las moléculas de mayor tamaño, posteriormente saldrán las de tamaño intermedio, y con el volumen total del líquido contenido en el lecho cromatográfico saldrá la molécula más pequeña.

Durante las actividades de la Semana de la Ciencia en Madrid, solemos poner un ejemplo práctico y muy vistoso sobre esta última descripción. Colocamos una mezcla de moléculas de azul de dextrano, la proteína verde fluorescente y el ferricianuro potásico. ¿Cuál saldrá con el volumen de exclusión? ¿Cuál saldrá en el volumen de elución (volumen intermedio)? ¿Cuál saldrá en el volumen total?
Para saber la respuesta, bastará con conocer el tamaño de cada una de estas moléculas y comprobarlo en la práctica.

Pistas: el azul de dextrano es un polímero de azúcares que forma cadenas largas y grandes, es de tamaño superior al ferricianuro potásico. La proteína verde fluorescente también es de mayor tamaño que el ferricianuro potásico.

Os animo a poner vuestras respuestas en la sección de comentarios… nos vemos en la Semana de la Ciencia.

Bibliografía:
J.M. García-Segura, J. G. Gavilanes, A. Martínez del Pozo, F. Montero, M. Oñaderra, F. Vivanco. Técnicas Instrumentales de Análisis en Bioquímica. 2007. Ed. Síntesis.

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Apuntes de Bioquímica

Tema20-Ciclo de Krebs
Ciclo de Krebs. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

La Bioquímica es un área apasionante, lleno de posibilidades y aplicaciones. En este apartado añadiré una serie de lecciones que he ido confeccionando para facilitar el estudio de la asignatura. Me he basado en el programa que se imparte en la carrera de Biología de la Universidad Complutense de Madrid, mi antigua profesora María Dolores Aragonés fue principal responsable para que adquiriera el mayor interés posible por la asignatura.

Estoy elaborando el PDF “Lecciones de Bioquímica” con todos estos contenidos para su descarga.

Temario

  1. Estructura de los aminácidos
  2. El enlace peptídico
  3. Estructuras de las proteínas
  4. Características del plegamiento proteico 
  5. Enzimas, funcionalidad de las proteínas
  6. Tipos de catálisis
  7. Cinética enzimática
  8. En desarrollo
  9. Bioenergética, parte 1
  10. Bioenergética, parte 2
  11. Ciclo de Krebs, parte 1
  12. Ciclo de Krebs, parte 2
  13. Ciclo de Krebs, parte 3 y cadena transportadora de electrones
  14. Glicolisis

Todas las imágenes son del libro de texto “Principles of Biochemistry” Lehninger. Las imágnes son de acceso libre cedidos por la editorial.

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