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¿Qué es la RMN?

Resonancia magnética nuclear o RMN.

En el laboratorio de RMN de alto campo del CSIC nos encargamos de aplicar esta técnica para caracterizar moléculas biológicas fundamentalmente.

La biología estructural se encarga del estudio de las propiedades estructurales y dinámicas de las proteínas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas dentro de un contexto biológico.

Por RMN se determinan las posiciones de cada uno de los átomos que constituyen la molécula. Para ello, se necesita que la muestra se encuentre normalmente en disolución acuosa. De esta forma se puede estudiar su plegamiento y dinámica, lo cual es de gran interés para el desarrollo de fármacos.

Del mismo modo, la RMN en estado sólido permite la caracterización de estas macromoléculas en un contexto complementario a la aproximación anterior. Se puede estudiar de tal forma proteínas de membrana, neuroreceptores, canales iónicos, fibras amiloides, etc.

La RMN también puede aplicarse a estudios metabolómicos en la que los fluidos corporales es la muestra de mayor interés para este tipo de estudios (sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, etc). Por RMN se puede generar un perfil de estos fluidos extraídos de las muestras obtenidas para tener un perfil.

La resonancia magnética nuclear de imagen (RMI o MRI) es una técnica empleada en radiología que se aprovecha de la localización zonal del agua y tejido adiposo para elaborar un mapa 2D y 3D. El sonido característico se debe a la contracción y expansión de la bobina, que genera una vibración audible de hasta 120 dB. Hay que tener en cuenta que la RMI es en realidad RMNI o resonancia magnética NUCLEAR de imagen, pero por miedo se ha quitado la palabra nuclear del nombre en los hospitales, debido a que la gente entraba aterrada a hacerse este tipo de pruebas.

Es importante mencionar que la RMN NO ES UNA TÉCNICA QUE APORTE RADIACTIVIDAD, el término nuclear infunde un miedo sin sentido real y estricto. La técnica es nuclear porque se aprovecha de las propiedades del núcleo del átomo. Así como una célula tiene un núcleo y no lo asociamos a radiactividad, hay que erradicar la idea del término nuclear como peligroso o dañino.

Nos centraremos aquí en la RMN en disolución de proteínas y péptidos.

El fenómeno de la RMN ocurre porque los núcleos atómicos poseen una propiedad mecanocuántica denominada spin nuclear que es fijo para cada tipo de núcleo. Los núcleos con spin distinto de cero se comportan como una distribución finita de carga y por tanto, tienen un momento magnético proporcional y paralelo al espín nuclear. Esto quiere decir que se comportan como pequeños imanes.

En función del ambiente molecular que rodee los distintos núcleos, se podrá trazar un mapa en el espacio que definirá finalmente el plegamiento, la dinámica y las posibles interacciones intra o intermoleculares a escala atómica.

La RMN no es la única técnica empleada para elucidar la estructura de biomoléculas a escala atómica, la difracción de rayos X y la cryo-EM también aportan mucha información. Pero las limitaciones de cada técnica se ven solventadas por otra.

Como toda técnica de uso para caracterización biomolecular, la RMN posee ciertas ventajas y desventajas en el momento de recurrir a ella.

VENTAJAS

Una de sus principales ventajas es que se trata de una técnica per se no destructiva, eso significa que una vez finalizado el experimento, se puede recuperar el material biológico y volver a ser empleado en sucesivos experimentos.

Al estar en disolución, estamos ralizando un estudio básicamente en su estado nativo y más cercano al que se podría encontrar en un sistema vivo. Es de suma importancia en el área biomédica el poder emular experimentos lo más cercanos a lo que se encontraría in vivo.

Obtenemos información tridimensional de la molécula en su estado plegado, parcialmente plegado, o desplegado (como las proteínas intrínsecamente desplegadas) o ver distintas conformaciones y encontrar la mayoritaria en el caso de los péptidos. Todas estas posibilidades se pueden encontrar en la naturaleza y estudiarse por RMN a escala atómica.

Otra de las enormes ventajas que tenemos, es el estudio de la dinámica molecular. Las biomoléculas no son entes rígidos, la dinámica les otorga funcionalidad biológica y el ser capaces de estudiar dicha capacidad de movimiento es un gran plus a la RMN en comparación con otras técnicas.

Podemos ver también cómo afectan los cambios de temperatura, de pH, el tipo de disolvente o comparar una proteína en su estado libre o unido a su ligando haciendo titulaciones.

LIMITACIONES

Como no todo son ventajas, algunas de las limitaciones las podemos encontrar en su bajo nivel de sensibilidad y debido a ello, la técnica está actualmente limitada a determinado tamaño de moléculas, hacia alrededor de los 30kDa, el tamaño máximo de las proteínas susceptibles de ser investigadas por RMN está en torno a los 60-80 kDa para las técnicas de rutina pero estos límites pueden ir aumentando a medida que haya avances en la tecnología.

También debido a su sensibilidad, la cantidad de material de estudio necesario tiene que ser grande, en el rango de los miligramos por cada 500 microlitros y el tiempo de adquisición varía entre un día o semanas.

Esta técnica es muy costosa, no únicamente en el instrumental necesario y su mantenimiento como el tener que rellenar los espectrómetros con nitrógeno y helio líquidos, sino que las muestras para estudio pueden necesitar un marcaje isotópico (no asociemos isótopo con radiactividad, hay isótopos no radiactivos y son los que empleamos) que lo encarece muchísimo.

El personal tiene que tener una formación muy especializada en RMN, por ello en el equipo contamos con físicos, químicos y bioquímicos que trabajan sinergia. Esta técnica no es de la que los fundamentos se aprenden en un par de días y se necesitan cursos específicos de capacitación para los que empleamos estas técnicas.

Finalmente, para asignar un espectro de resonancia, hace falta dedicar mucho esfuerzo y tiempo.

MATERIAL DE PARTIDA

Para adquirir los espectros de RMN, es necesario que las muestras estén en presencia de un campo magnético. Para el estudio estructural de proteínas se requieren campos magnéticos de al menos 500 MHz o una frecuencia de precesión de 11.7 T, llegándose en la actualidad a conseguirse hasta espectrómetros de 1 GHz.

Los núcleos empleados para estudio, como he mencionado antes, tienen que tener un spin nuclear distinto a cero y contamos para ello con distintos isótopos como el carbono 13, nitrógeno 15, fósforo 31.

Marcamos isotópicamente porque la abundancia natural de estos núcleos es realmente baja, como el 13C que ronda el 1.1%, mientras que el 15N del 0.37%. En función del tamaño de la molécula a estudiar, será necesario o no el marcaje isotópico mediante el empleo de técnicas de Biología Molecular.

La magnitud del campo magnético de los espectrómetros de RMN suele expresarse como la frecuencia de resonancia del protón, siendo la sensibilidad y la dispersión de las señales mayores al aumentar el campo magnético. Cuanto mayor sea el tamaño de la biomolécula, mayor será el campo magnético mínimo requerido para su estudio estructural.

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  • S = señal
  • N = ruido (noise)
  • B0 = Campo magnético

La sensibilidad (S/N) está relacionada con el campo magnético, como podemos ver en esta ecuación en el numerador.

Los núcleos con espín diferente a cero pueden considerarse como pequeños imanes que colocados dentro de un campo magnético tienen una energía que depende de su orientación respecto al campo. Estas energías se encuentran cuantizadas. El nivel de menor energía está más poblado que el de mayor energía, la diferencia de poblaciones entre los dos niveles es muy pequeña y esto hace que la sensibilidad de la RMN sea pequeña y hagan falta muestras concentradas para la adquisición de los espectros, debido a que la señal de RMN es consecuencia de las transmisiones entre los niveles de energía.

Las transiciones entre los niveles de energía ocurren al aplicar pulsos de radiofrecuencia.

Por otra parte, una criosonda hace que R·T  en el denominador sean muy bajos y por lo tanto, la relación señal/ruido sea mayor.

ELUCIDACIÓN DE LA ESTRUCTURA

Las etapas para la determinación de las estructuras no son independientes entre sí, sino que en función de los resultados que se vayan obteniendo, puede ser necesario volver a pasos anteriores.

Es necesario tener una muestra adecuada para el estudio, optimizar las condiciones de experimentación, adquirir los espectros de resonancia y proceder al cálculo y obtención de estructuras finales.

Hay que tener en cuenta que las macromoléculas son moléculas grandes y que a medida que su peso molecular aumenta, el tiempo de correlación también lo hace y las señales del espectro serán más anchas. Es por eso que se recurre a la espectroscopía multidimensional y al etiquetado isotópico de las moléculas de estudio.

Durante la preparación de la muestra, hay que tener en cuenta el tamaño con el que trabajamos, si estamos con péptidos puede no hacer falta un etiquetado isotópico y bastar con espectros homonucleares (como un espectro bidimensional de protón o “protón-protón”). Por otro lado, en el caso de moléculas más grandes, esto no puede se una opción porque se obtendría un espectro muy difícil de analizar en el que se se ve la presencia de un gran número de señales, además del gran solapamiento de señales que caerían en el mismo sitio.

Para estos casos, es necesario recurrir a la espectroscopía multidimensional en 2D, 3D, 4D y un marcado isotópico.

En cuanto al marcaje isotópico, estamos hablando de una etapa muy costosa durante la obtención del material de estudio. Para obtener las proteínas etiquetadas en nitrógeno 15 y/o carbono 13, hace falta emplear técnicas de Biología Molecular para producir proteínas recombinantes como hacer crecer en un medio de cultivo ricos en isótopos  los organismos que sintetizarán la proteína de interés. Es un proceso caro, lento y muy difícil de conseguir.

Para el etiquetado isotópico, se puede marcar la proteína completa, alguno de los dominios, una parte de la proteína, el ligando, el receptor, ambos o incluso el DNA o RNA.

En un espectro protón-protón de grandes moléculas se ven un solapamiento de las señales. Para poder separar esas señales un espectro heteronuclear da rangos de separación mucho más amplios. Gracias a la variación de los desplazamientos químicos del 15N, se pueden separar.

Las condiciones deben ser óptimas para la adquisición de los espectros de resonancia y para ello, la muestra tiene que ser soluble, estar muy concentrada, muy bien purificada, estar correctamente plegada en la forma que se desee estudiar ya que no aplica igual para péptidos o proteínas intrínsecamente desestructuradas, también debe ser una muestra monodispersa o que no haya agregados, que no tenga partículas sólidas ni impurezas paramagnéticas y sea estable a una determinada temperatura y pH a lo largo del tiempo de adquisición de los espectros.

Se pueden variar distintos parámetros como el pH, la temperatura, los tampones, la fuerza iónica, la concentración para tener las condiciones óptimas de adquisición. Pero siempre tomando en consideración el problema biológico acerca del que se pretende obtener información, así como la estabilidad y la solubilidad de la proteína.

Se trata de encontrar las condiciones que mejor reproduzcan aquellas en que la proteína es biológicamente activa y en las que a su vez sea posible la adquisición de espectros de RMN. Por esta razón, la estructura suele determinarse en disoluciones acuosas, a temperaturas menores o iguales a 35ºC y a pH inferior a 7 ya que por encima de 7 dejan de observarse algunas señales de RMN de interés.

ADQUISICIÓN DE LOS ESPECTROS DE RESONANCIA

Las transiciones entre los niveles de energía ocurren al aplicar pulsos de radiofrecuencia.

En una muestra que contenga un gran número de núcleos con la misma frecuencia de Larmor, existirá una magnetización neta paralela al campo. Dependiendo de la duración del pulso de radiofrecuencia, el vector de magnetización girará en un ángulo distinto en el plano yz. Un pulso de 90º lleva la magnetización al eje y.

Después del pulso de 90º, la magnetización precesa en el plano xy alrededor del campo magnético situado en el eje z, generando señales de radio que decaen exponencialmente con el tiempo y dan origen a la FID (Free Induction Decay).

La transformada de Fourier de la FID pasa del dominio de los tiempos al de las frecuencias, dando lugar al espectro de RMN.

En función de la naturaleza de la biomolécula a estudiar, se decidirán distintos tipos de experimentos.

Una vez seleccionadas las condiciones de preparación de la disolución de la molécula bajo estudio, si la calidad y características del espectro 1D de protón son adecuadas, se puede proseguir con la obtención de los espectros multidimensionales requeridos para la determinación de su estructura. En caso contrario, se modifican las condiciones hasta encontrar unas apropiadas para la obtención de espectros de RMN. Mediante el examen del espectro monodimensional, se evalúa el estado de la muestra en cuanto a la presencia de impurezas, relación señal-ruido y estado nativo o desnaturalizado.

De esta forma, la información del 2D se puede resolver en la tercera dimensión.

PROCESAMIENTO DE DATOS

Cualquier determinación estructural por RMN requiere la asignación de las señales de resonancia a núcleos individuales de la molécula bajo estudio. Existen estrategias de asignación bien establecidas que constan de distintas etapas.

Esta etapa podría estar ayudada por sistemas automáticos informáticos, pero no son del todo perfectos y siempre necesitan de la intervención humana.

La asignación de un espectro de resonancia consiste en la identificación de las señales de RMN correspondientes a sistemas de spin independientes para cada aminoácido y la asignación secuencial de los residuos antes identificados. Dicho en otras palabras; se trata de identificar cada protón para cada aminoácido, ponerle su nombre y posteriormente asignarle el número que le corresponde en secuencia hasta completar la proteína o péptido.

De momento nos centraremos en un ejemplo para un sistema pequeño en el que tenemos espectros homonucleares (dos dimensiones de protón) COSY, TOCSY y NOESY.

Con los espectros COSY restringimos las conectividades a tres enlaces porque no disponemos de la resolución suficiente para ir más lejos. En los espectros COSY aparecen señales de correlación entre protones acoplados escalarmente, lo que permite identificar las señales NH-Halfa, Halfa-Hbeta de un mismo aminoácido. Une entonces el protón amídico con el protón alfa, el protón alfa con el beta, el beta con el gamma, y así sucesivamente.

De esta forma, continuamos con los experimentos TOCSY en que que vemos enlaces situados en el mismo sistema de spin o que corresponden al mismo aminoácido. Así, encontramos señales de correlación entre todos los protones pertenecientes a un mismo sistema de espín. La señal del protón amídico del aminoácido 1 da con la del protón alfa del mismo, con el protón beta, con el gamma, con el épsilon… y así hasta completar ese aminoácido en concreto.

Finalmente, los espectros NOESY nos dan información a largo alcance, de alrededor 5A o menos. La conexión secuencial de los sistemas de spin asignados se lleva a cabo a partir de los NOE entre protones de residuos contiguos en la secuencia observados en un 2D o 3D NOESY. La intensidad, el número y tipo de las correlaciones NOE secuenciales que se observan en cada segmento de la cadena dependen de la estructura secundaria, pero siempre habrá una distancia menor a 3A en residuos contiguos que da lugar a un efecto NOE intenso. Los espectros NOESY nos tan por lo tanto, información espacial.

El efecto nuclear Overhouser es el parámetro de RMN más importante desde el punto de vista estructural. Por el efecto NOE se transfiere magnetización entre núcleos próximos en el espacio, dependiendo la eficacia de esta transferencia y, por tanto, la intensidad del efecto NOE observado. Esta dependencia hace que el efecto NOE entre dos protones sea observable si estos se encuentran a una distancia inferior a 4,5-5 A, puesto que por encima de esta distancia, la intensidad NOE se hace tan pequeña que no se detecta experimentalmente. La observación de señal NOE entre protones alejados en la secuencia de la proteína indica que estos se encuentran espacialmente próximos, lo que restringe en gran medida el espacio conformacional de la proteína. Para el cálculo de las estructuras tridimensionales, la intensidad de los NOE se traduce en cotas superiores para las distancias entre pares de protones.

CÁLCULO DE LA ESTRUCTURA DE RMN

Se basa en convertir la información de las intensidades de señales y valores de desplazamientos químicos en restricciones de distancia y valores angulares.

El cálculo de una estructura consiste en encontrar el conjunto de estructuras o confórmeros cuyas coordenadas atómicas satisfagan todas las restricciones experimentales, de distancia, angulares y de orientación, proporcionadas por los parámetros de RMN. El método de cálculo debe ser capaz de ajustar todas las restricciones experimentales y de explorar adecuadamente el espacio conformacional.

Los algoritmos de cálculo empleados son métodos de geometría de distancias que consisten en la minimización de una función blanco variable operando generalmente en el espacio de ángulos de torsión. La función blanco es cero si se cumplen todas las restricciones experimentales.

Tras n iteraciones, se pueden añadir o generar restricciones adicionales hasta que se procede al refinamiento para obtener los confórmeros finales.

Para que la estructura resultante sea válida, el número y la magnitud de las denominadas violaciones de las restricciones, debe ser mínimo. El mapa de Ramachandran también se emplea para la validación de estructuras obtenidas.

Por RMN se obtiene un conjunto de estructuras, la estructura calculada (o los confórmeros) se representa como la superposición de entre las 10 y 20 estructuras que mejor satisfacen las restricciones experimentales. La convergencia de los datos experimentales a una única estructura se mide mediante la desviación cuadrática media entre los átomos de las estructuras o RMSD. La convergencia de los datos experimentales a una única estructura se mide por el valor RMSD.

Las estructuras calculadas pueden representar regiones muy bien definidas y otras desordenadas, los parámetros dinámicos de RMN permiten comprobar si esta falta de orden refleja la existencia de una región muy flexible en la estructura de la proteína.

CONTEXTO BIOLÓGICO

Como estamos en un contexto biológico, nos interesa también estudiar las proteínas en un ambiente similar al de las membranas. Lo más parecido a ellas que nos permite su estudio por RMN en disolución es el empleo de micelas de detergente como el DPC o el SDS.

El DPC y el SDS se pueden deuterar por completo, lo cual nos permite ver analizar el espectro y la conformación de la proteína en su presencia pero sin que las señales de la micela se superpongan con las de la molécula de estudio.

Una vez obtenidos los datos, se procede a hacer el mismo espectro con las micelas con la mitad de la población deuterada para poder ser capaces de ver las posibles señales NOE entre micela y residuos.

Una vez asignadas las señales de RMN de una proteína y sin necesidad de una determinación estructural completa, la RMN permite el cartografiado de los aminoácidos implicados en la unión a un ligando. Para ello, se comparan espectros del mismo tipo de la proteína libre y en el complejo.

La transferencia del efecto NOE entre dos protones en una molécula ligada a otra ocurre mediante intercambio químico entre las formas libre y ligada de la molécula. Si se consideran que los protones están alejados, no habría lugar a un efecto NOE observable.

Del mismo modo que si hay interacción, se pueden ver diferencias significativas en los desplazamientos químicos. El hecho que no se observen puede ser indicio que no hay interacción.

DINÁMICA

Las proteínas no son rígidas, para tener su funcionalidad biológica hace falta que actúen con cierta flexibilidad. Dicha flexibilidad les otorga la capacidad de reconocer ligandos y adaptarse a ellos o de realizar funciones enzimáticas.

Por RMN se puede estudiar los grados y las regiones de mayor flexibilidad, lo cual correctamente analizado puede ser indicio de la presencia de dinámica. Al obtener distintos confórmeros por RMN, podemos observar qué zonas se mantienen más estables en el espacio-tiempo y por tanto, los valores de RMSD serán inferiores mientras que las zonas de mayor movimiento presentarán valores de RMSD mayores.

VÍDEOS EXPLICATIVOS

Curiosidades científicas de la vida cotidiana

El veneno está en la dosis: botulismo y botox.
En ocasiones vemos latas, tetrabricks de zumos y otros productos hinchados. Se desaconseja tajantemente consumirlos ya que podrían contener una bacteria llamada Clostridium botulinum. Esta bacteria sintetiza una toxina que actúa sobre el sistema nervioso dando lugar a la enfermedad conocida como botulismo a través de la ingesta de productos en los que ha crecido la bacteria, dando lugar a desenlaces fatales. Curiosamente, tras investigar el modo de acción de esta neurotoxina, se ha empleado en menor dosis para usos médicos y estéticos: el botox. Debido a la capacidad para bloquear la liberación de la acetilcolina, se bloquea la transmisión del impulso nervioso, y actualmente se emplea como tratamiento estético para evitar la aparición de arrugas en el rostro. Otro de los usos que se le da, es para el tratamiento de la hiperhidrosis, personas que sufren de sudor excesivo en manos y otras zonas del cuerpo que les impide llevar una vida normal.

Mr. Bean y el medio de cultivo.
En el episodio “Do it yourself”, se observa a Mr. Bean sazonando unos trozos de ramas de árbol con el clásico inglés Marmite. El Marmite es en realidad un preparado de extracto de levadura. En el laboratorio, se emplea este mismo material en polvo para elaborar medio de cultivo (LB, Ψ Broth, entre otros) para que las bacterias de uso biotecnológico como Escherichia coli crezcan. Se trata de un medio rico en nutrientes necesarios para ellas.

Los ingredientes para preparar un litro de medio LB (Luria Bertani) son:
10g de triptona
10g de NaCl
5g de extracto de levadura

Naranja langostino, naranja zanahoria.
¿Por qué cambian de color al cocerlos?
Los crustáceos sintetizan una biomolécula perteneciente al grupo de los carotenoides. Estas moléculas se pueden encontrar en distintos alimentos anaranjados y rojizos como las zanahorias (beta-caroteno) y los tomates (licopeno), aportando así su color característico y apetitoso. En los crustáceos, el carotenoide se encuentra asociado a una proteína que provoca un cambio en las propiedades ópticas y de esta forma puede camuflarse con el medio. Al elevar la temperatura, la proteína se desnaturaliza y el carotenoide se libera, recupera sus propiedades ópticas y da lugar a la aparición del característico color.

Los plátanos y sus semillas abortadas.
Esos pequeños puntos que vemos al comer un plátano o una banana, en realidad son los restos de los “abortos” de las semillas y no semillas en sí. El fruto de estas plantas no podría ser comestible de no ser por su distribución no equitativa de los cromosomas. Se trata de un cruzamiento de un organismo diploide o 2n (con un par de cromosomas, como los humanos) con uno tetraploide o 4n (dos pares de cromosomas), al “juntarse”, tendríamos tres pares de cromosomas 6n que al sufrir meiosis, darán lugar a un organismo triploide o 3n. Al ser triploide (tres juegos de cromosomas), no producirá semillas fértiles al no poder distribuir equitativamente los cromosomas porque 3/2 no da un número entero. Estas plantas se propagan por clonación y una de las variedades más populares es la Cavendish.

Al igual que los plátanos, otras variedades de frutos sin semillas pueden obtenerse por el mismo método como las sandías sin pepitas (erróneamente la gente las considera como transgénicas).

Bioquímica 7: cinética enzimática

En la entrada anterior, se habló sobre los distintos tipos de catálisis que podemos encontrar en las enzimas. Para seguir la actividad de una enzima y poder desarrollar inhibidores eficaces, ver cuál es la temperatura, el pH y otras variables físicoquímicas que determinan el ambiente óptimo para su máxima funcionalidad; los bioquímicos empleamos una serie de ecuaciones y representaciones de la cinética de la reacción.
Estas representaciones miden la velocidad (no en parámentros termodinámicos) de la reacción en presencia o ausencia de inhibidores, variando las distintas condiciones del medio.

Propongamos los siguientes supuestos:

  1. [S]>>[E] Esto quiere decir que la concentración de sustrato es mucho mayor que la de enzima.
    Mediremos la concentración de los intermediarios de reacción (complejo enzima-sustrato), a lo largo del tiempo disminuirá la concentración de enzima libre al haber exceso de sustrato. Entonces aparecerá el complejo enzima-sustrato ES.
  2. Estado estacionario: Llegamos al punto en que la concentración ES permanece constante, aunque la velocidad de aparición del producto sea lineal con el tiempo.
    A medida que pasa el tiempo, existe la posibilidad que el complejo enzima-producto EP sufra la reacción inversa en dirección al complejo ES.
    Este momento estacionario, en el que el que la concentración ES permanece constante es muy interesante para determinar cuál es la velocidad de la reacción, sirve para analizar con qué rapidez aparece el producto y la velocidad de formación del complejo ES es la misma que la de su desaparición al obtenerse el producto.
  3. Velocidad inicial: Es a la cual aparecen los primeros productos.

En términos matemáticos, en el estado estacionario la diferencia de la concentración ES en función del tiempo es igual a 0. Por lo tanto, se determina que [ES] es constante.

ec 1La velocidad de formación del complejo es la misma que la de desaparición.
Velocidad de formación V

ec 2

ec 3

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Bioquímica 6: tipos de catálisis

En el tema anterior, se habló sobre las enzimas. En este se tratará sobre el tipo de catálisis que llevan a cabo.

Los mecanismos de catálisis son fundamentalmente cuatro:

  1. Catálisis por aproximación: mediante el establecimiento de interacciones E-S. Reduce la entropía para que la reacción sea más favorable gracias a los efectos de proximidad y orientación.
  2. Catálisis ácido-base
  3. Catálisis covalente
  4. Catálisis por distorsión

CATÁLISIS POR APROXIMACIÓN:
Ocurre en todas las enzimas. Como su nombre indica, aproxima los sustratos (reactantes) y hace que la probabilidad de encuentro entre ellos sea mayor. La reacción puede ser uni o bimolecular.

CATÁLISIS ÁCIDO-BASE:
La enzima favorece la reacción actuando como ácido o como base. Se trata de un tipo de catálisis bastante frecuente en las enzimas. Los residuos de las enzimas favorecen la reacción actuando como ácido o como base (o ambos) mediante la transferencia de protones al activar la molécula de agua haciéndolo más reactivo.
La base desprotonada puede captar un protón del agua, dando lugar a un radical hidroxilo que puede formar un enlace con otro átomo.

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Ejemplo de catálisis básica, donde E = enzima y B = residuo básico.

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Enzimología 1: Concepto de enzima y actividad enzimática.

En primer lugar hay que establecer la coordenada de reacción: En un sistema en que se dé una reacción, la evolución del sistema en el tiempo va desde el estado inicial hasta que el sustrato se convierte en producto. Se puede usar en término de cualquier variable, como la energía libre.
En el estado inicial, la energía libre del sistema es la energía libre del sustrato y la energía libre del sistema al final, es la del producto. Se puede definir a ΔG como la ENERGÍA LIBRE, si es negativo es porque la energía libre del producto es inferior a la del sustrato =-ΔG, es un proceso termodinámicamente favorable y se ha liberado energía. Si ΔG fuera positivo, habría que aportar esa energía libre al sistema para que el sustrato pueda transformarse en producto.

La energía libre desde el punto de vista termodinámico, si es desfavorable o no y cuánto.
En una reacción ΔG<0, el sustrato no se convierte espontáneamente en el producto porque el sustrato debe pasar por un estado de sustrato activado (debe pasar por un estado de transición) que es muy inestable, para que el sustrato se transforme en el producto debe pasar por un estado de transición y necesita una energía de activación (Ea) para que salte a ese estado. Hay que iniciar la reacción, esa Ea en muchos casos hay que aportarla desde fuera, en forma de calor, agitación, etc.

En cualquier reacción química hay que tener varios parámetros: ΔG (informa de la constante de equilibrio, de la favorabilidad termodinámica) y la Ea. En muchos casos la Ea debe ser del orden de la temperatura en que el sistema se encuentra. Si se da a temperatura baja, es porque la Ea tiene una barrera más baja.

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Cinética enzimática. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

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