Archivos mensuales: Septiembre 2015

Bioquímica 3: Estructuras de las proteínas

Anteriormente, vimos cómo se establece el enlace peptídico. Ahora toca definir cómo sufre modificaciones que dan lugar a la gran variedad de proteínas.

Primero, hay que dejar claro que los conceptos configuración y conformación no son intercambiables.

Estructura nativa: estructura de una proteína que tiene función biológica.

Configuración: L-aminoácidos no son interconvertibles por giro.
El enlace peptídico tiene cierto carácter de doble enlace. Los enlaces sencillos tienen libertad de giro, pero el enlace peptídico no.
Conformación: orientaciones espaciales de sustituyentes del átomo de C interconvertibles por giro. Las conformaciones pueden ser en α-hélice, láminas beta, irregulares o random. La conformación son los giros a través de los enlaces.

De una cadena peptídica única: primaria, secundaria y terciaria.
Dos o más cadenas: cuaternaria.
Estructura primaria: estructura primaria de los aminoácidos.
Estructura secundaria: cómo se orienta en el espacio: hélices alfa, láminas beta… los plegamientos.
Estructura terciaria: Hay cadenas muy largas que pueden tener un fragmento en α-hélice y otros fragmentos láminas beta, giros, etc.
Estructura cuaternaria: Cuando una proteína se compone de dos o más cadenas peptídicas, cada una con su propio plegamiento.

En general, las proteínas que se quedan hasta la estructura secundaria, son proteínas fibrosas que tienden a tener una función estructural o de soporte.
Las proteínas con estructura terciaria o cuaternaria (o ambas) son proteínas globulares y tienden a ser relacionadas con una función enzimática.

RESTRICCIONES DEL PLEGAMIENTO:
Los aminoácidos tienen libertad de giro en el carbono α. El diagrama de Ramachandran es un modelo práctico que representa los giros permitidos.
Si el plano gira en sentido de las agujas del reloj, el valor es positivo. Y contrario es negativo.
Ángulos Psi ψ = 0 a -180º o 0 a +180º
Ángulos Fi ϕ: desde el carbono en alfa, 0 a -180º o 0 a +180º

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Ángulos del enlace peptídico. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

Estructura primaria:
Restricciones
1) En el enlace peptídico no hay libertad de giro.
2) Si los residuos tienen cadenas laterales grandes, no se podrán tener algunos grados de giro.
3) La carga de la cadena lateral también restringe el plegamiento
4) Prolina: representa la máxima restricción posible, crea un enlace peptídico del N cíclico con el carboxilo del otro aminoácido.
5) Gly es el caso opuesto a la prolina al tener como residuo R un hidrógeno.

ESTRUCTURA SECUNDARIA:
Ordenadas y no ordenadas.
1) Ordenadas: todos los ángulos ϕ y ψ son iguales:
a. alfa hélice φ -48º y ψ-57º
b. Beta laminar φ -140º y ψ +135º
c. Hélice colágeno φ -55º y ψ +145º
2) No ordenadas: valores de ϕ y ψ distintos

ALFA HÉLICE:
a) En proteínas fibrosas como α queratina.
b) En proteínas globulares como la mioglobina.

Características:
a) Giro a la derecha: dirección N al C, mirando afuera. Dextrógira.
b) Prolina es incompatible con la existencia de la α-hélice
c) Cadenas laterales R hacia fuera
d) Puentes de H extensibles. Se estabiliza creándose una serie de puentes de H al quedar un carbonito y un NH entre hélice y hélice siguiente (a una distancia de 5 Å aproximadamente). Son enlaces débiles. A alta temperatura, se pueden estirar algunas.

α-queratinas (pelo, uñas, cuernos):
Protección
La dureza se dará según el contenido en cisteína y se establecerán puentes disulfuro entre alfa hélices distintas entre ellas.
Pelo: capas de células muertas que se quedan como un depósito de alfa queratinas.
Son varios agregados para formar una estructura sólida, nunca es una proteína única en un péptido. Son agregados de agregados, de agregados con puentes disulfuro entre las cadenas contiguas.
Siempre van en la misma dirección. La cadena peptídica se enrolla a la derecha y cuando se asocian, se enrollan a la izquierda. Es un patrón que se repite también en las proteínas fibrosas.

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Estructura en alfa hélice. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

BETA LAMINAR:
β-queratinas (como la seda)
1) Hace un zig-zag
2) Los grupos –R quedan hacia arriba y hacia abajo.
3) aminoácidos pequeños y apolares.
4) No es una única cadena peptídica, son agregados agrupados que se estabilizan.
5) Las que están en un mismo plano se agrupan por puentes de H
Cuando las cadenas laterales R están en los huecos, hay una especie de interacción entre los H del NH y los O del COOH. Hay un entramado entre esas cadenas laterales, no es extensible (no se pueden estirar).
Es más estable la antiparalela que la paralela por la geometría de las cadenas peptídicas, en la antiparalela los cuatro átomos de H quedan alineados.

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Estructura en beta laminar. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

TRIPLE HÉLICE DEL COLÁGENO
Proteína fibrosa (cadenas peptídicas formando agregados de agregados de agregados).
Existen varios tipos de colágeno y a pesar que se trata de una hélice, no tiene nada que ver con la α-hélice.

1) Se enrolla a la izquierda
2) La hélice es mucho más abierta
3) Alto contenido de prolina y de hidroxiprolina, de lisina e hidroxilisina.
4) Secuencia: Nt X-X-Gly-X-X-Gly-X-X-Gly-→ COOH, el 33% es Gly y según los distintos aminoácidos que haya entre medias, da lugar a los distintos tipos de colágeno.
5) Se agrupan tres helices.
6) La hélice individual se enrolla a la izquierda pero cuando se asocian entre sí, se enrollan a la derecha para mayor interacción (lo contrario con la alfa-queratina).
7) Hay determinados puntos donde se aproximan las hélices y el único aminoácido que cabe es la Gly, las Pro hacen que sea una hélice muy abierta.

INTERACCIONES:
1) Puentes de H:
a. Entre átomos del enlace peptídico (como siempre) que quedan próximas. Las del NH con el C=O
b. Hay OH-Pro (hidroxiprolina), es un aminoácido proteico que no suele estar en otras proteínas, es un poco frecuente. Algunas prolinas de hidroxilan, así permiten crear puentes de hidrógeno entre ellas: OH—OH.
c. A veces a las OH-Lys se les unen azúcares (hay tipos de colágeno que son glicoproteínas) y esos azúcares unen agua. Dan lugar a gran variedad de tipos de colágeno; de esta forma, un tendón no tendrá la misma consistencia que un cartílago. El segundo tiene más cantidad de agua al tener más lisinas hidroxiladas: más OH-Lys → más azúcares → mayor afinidad por las moléculas de agua.
2) Fuerzas de Van der Waals: en el anillo de las prolinas.
3) Interacciones covalentes entre restos de Lys. Determinadas cadenas cuando quedan próximas, tienen interacciones covalentes fuertes Lys-Lys que tienden a aumentar con la edad.

La enzima que cataliza las hidroxilaciones es una hidroxilasa que necesita un átomo de hierro en su centro activo. Dicho átomo debe estar en su forma reducida (Fe2+) y un antioxidante garantiza ese agente reductor. La vitamina C es un agente antioxidante que se encarga que el hierro esté en forma reducida, es por ello que ante la falta de esta vitamina, se experimenten una serie de dolencias relacionadas con el colágeno como el escorbuto. Las OH-Pro estabilizan la cadena.

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La triple hélice del colágeno. Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

CARACTERÍSTICAS:
1) Sólo tienen estructura secundaria (tiene siempre una única dirección, nunca se retuerce sobre sí misma, porque cuando lo hace, obtenemos la estructura terciaria)
2) La entidad biológicamente activa son varias cadenas peptídicas (nunca una única cadena)
3) Ricas en aminoácidos apolares (en general) cuya función es dar estructuras de protección externa: impermeables, dureza, etc.
a. Protectoras
b. Impermeables
c. Insolubles

Estructura terciaria y cuaternaria: proteínas globulares
a) Formadas por una única cadena peptídica (a diferencia de las fibrosas): Estructura terciaria
b) Formadas por n cadenas peptídicas: estructura cuaternaria, cada una de las cadenas tiene estructura terciaria.

ESTRUCTURA TERCIARIA:
1) Modelos (esquemas más abundantes):
a. Alto porcentaje de α-hélice
b. Alto porcentaje en β-laminar
c. Combinan α-hélice y β-laminar
d. Alto porcentaje de estructura al azar (ángulos ϕ y ψ distintos)
2) Codos o giros (cambio de dirección en la cadena peptídica): la presencia de estos dan lugar a la estructura terciaria. Normalmente son antiparalelas (en la naturaleza lo antiparalelo se ha seleccionado contra lo paralelo).
a. Giros: Si es un giro muy cerrado, hay aminoácidos pequeños como Gly o Ala ya que son los que caben.
b. Codos: En las zonas un poco más abiertas, suelen ser estructuras al azar (zonas donde los ángulos son diferentes).
3) Estructuras supersecundarias: en realidad son terciarias. Agrupaciones que se repiten mucho.
4) Dominios
a. Desde el punto de vista estructural: dentro del plegamiento de una proteína grande, son zonas con un plegamiento más compacto.
b. Desde el punto de vista funcional: son zonas donde reside una determinada función. A veces coincide un dominio funcional con el estructural.
5) Distribución de los aminoácidos según su polaridad: La mayoría de las proteínas son solubles y si están en medio acuoso, los aminoácidos apolares se agrupan en el interior (efecto hidrófobo); exceptuando a las proteínas del citoesqueleto que son insolubles.

ESTRUCTURA CUATERNARIA:
Más de una cadena peptídica, pero cada una tiene estructura terciaria.
Unidas por interacciones no covalentes entre las cadenas laterales de aminoácidos.
En general, la cantidad de cadenas se encuentra en números pares.
Algunas veces se ven uniones por interacciones covalentes (hay autores que las engloban en la misma).
La mioglobina tiene estructura terciaria, pero la hemoglobina es cuaternaria.

MOVIMIENTOS EN LAS CADENAS PEPTÍDICAS:
Podemos encontrar:
Vibraciones y oscilaciones de átomos y grupos individuales.
Movimientos de elementos estructurales como hélices α y grupos de residuos.
Movimiento de dominios completos, apertura y cierre de hendiduras.

En el siguiente capítulo veremos cómo se pueden desestabilizar estas estructuras.

REFERENCIAS
D. L. Nelson, M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th edition, 2008. Ed. Freeman.
Voet, Voet. Bioquímica 3rd edition, 2006. Ed. Médica Panamericana.

Enlace: lecciones de Bioquímica.

Bioquímica 2: El enlace peptídico

Este tema es continuación al que trata sobre la estructura de los aminoácidos. 

La forma de polimerización de los α-aminácidos es a través del enlace peptídico. La unión ocurre cuando el grupo carboxilo de un residuo condensa con el amino de otro y se libera una molécula de agua. COO + NH3 → CO-NH + H2O

El enlace peptídico no se ioniza, es un enlace plano.
A partir de la unión de dos o más aminoácidos a través de un enlace peptídico, surgen los péptidos y las proteínas. La frontera entre péptido y proteína no se encuentra bien establecida y los bioquímicos se guían más por su estructura, función y tamaño para determinar si se trata de uno o de otro. Un bioquímico puede decir que considera proteína si ésta se compone como mínimo de 100 aminoácidos, otro podría decir que es a partir de 50.

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Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

PÉPTIDOS NATURALES
Tienen estructuras muy diversas y se pueden encontrar tanto aminoácidos proteicos como no proteicos (D y L). Del mismo modo, puede haber enlaces peptídicos anómalos.

CARNOSINA: β-ala-his. Como la His actúa como un tampón natural y se puede encontrar en músculos y el sistema nervioso.

GLUTATIÓN: γ-glu-cys-gly. Tiene un enlace peptídico anómalo, forma el enlace con el carbono lateral y no con el carbono α.
Su funcionalidad se debe a la reacción: 2 glutationes se pueden unir a través de un enlace disulfuro reversible y garantiza que con un agente oxidante, el glutatión puede oxidarse. Normalmente abunda más más en su forma reducida y cuando una célula se ve atacada por un agente oxidante, el glutatión efectúa su acción antioxidante.
A los grupos tiol (SH) se les puede asociar a una función antioxidante.

NEUROPÉPTIDOS: Péptidos ubicados en el sistema nervioso.
Regulan muchísimas funciones, como ejemplos pueden encontrarse los péptidos opiáceos similares a la morfina y cuyos receptores se encuentran en el sistema nervioso.
Tridimensionalmente aunque su estructura no sea la misma, se parecen mucho a la morfina, así que “engaña” (mimetismo molecular) a los receptores de esos péptidos.
Péptidos opiáceos: endorfinas, encefalinas.
Realizan su función en la regulación de la respiración, el humor, las vías del dolor, etc. Durante una agresión, se experimenta una inhibición del dolor momentáneo regulado por estos neuropéptidos que en consecuencia, sirven para huir del agente dañino.

ANTIBIÓTICOS: Gramicidina, un péptido cíclico compuesto por L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn—L-Leu—D-Phe—L-Pro—L-Val—L-Orn.

Aspartamo: Un péptido no natural que se utiliza en la industria alimentaria como edulcorante. L-Asp—L-Phe, la Phe se encuentra metilada en el carboxilo terminal.

Continuaremos con el tema de las estructuras de las proteínas.

REFERENCIAS
D. L. Nelson, M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th edition, 2008. Ed. Freeman.
Voet, Voet. Bioquímica 3rd edition, 2006. Ed. Médica Panamericana.

Enlace: lecciones de Bioquímica.

Bioquímica 1: Estructura de los aminoácidos

En esta entrada haré una mención sobre los aminoácidos.
Los aminoácidos son los ladrillos fundamentales por los que se componen las proteínas. Los α-aminoácidos se caracterizan fundamentalmente por tener un grupo amino (NH2-NH3+), un carboxilo (COOH – COO) y un protón unidos al carbono denominado carbono α (exceptuando la prolina). La cadena lateral R es característica para cada aminoácido y es lo que dará la gran riqueza y variación estructural y funcional a los péptidos y proteínas.
Sus grupos ácido COOH y base NH2 hacen que un aminoácido pueda actuar como ácido o base, por ello se dicen que son moléculas anfóteras. A pH fisiológico, el grupo carboxilo está desprotonado (COO) y el NH protonado (NH3).
Según la orientación del grupo amino en relación con el carbono asimétrico, éstos se pueden denominar D o L. La forma L tiene el grupo amino a la izquierda (no hay que confundir con dextrógiro o levógiro).

Clasificación por funcionalidad:

  1. Proteicos: α y L-aminácidos
    Forman parte de las proteínas, son una fuente de carbono, nitrógeno y energía. Son precursores de neurotransmisores y hormonas.

    1. Aminácidos comunes (20): al menos cada uno tiene un triplete de bases codificador definido por el código genético.
    2. No comunes: vienen de modificaciones postraduccionales.
  2. No proteicos: α, β, L-, D-. Poseen estructuras y funciones muy distintas. Se pueden encontrar en las paredes bacterianas, componentes de antibióticos, intermediarios en las rutas metabólicas, etc. Y por sus características, tienen funciones muy heterogéneas.
    Otra de las características es que el grupo amino puede encontrarse en cualquier posición (α, β…).

Como bioquímico, no sólo es conveniente, sino una necesidad saber las propiedades de cada aminoácido y sus códigos de tres y una letra.

 Aminoácido  Código de tres letras  Código de una letra
Alanina
Cisteína
Ácido aspártico
Ácido glutámico
Fenilalanina
Glicocola o glicina
Histidina
Isoleucina
Lisina
Leucina
Metionina
Asparagina
Prolina
Glutamina
Arginina
Serina
Treonina
Valina
Triptófano
Tirosina
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Tema01-aminoacids
Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

Estudio de la cadena lateral R de los aminácidos:
Los aminoácidos pueden clasificarse en función de las propiedades de sus cadenas laterales.

  • No polares
    • Alifáticos: Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina
    • Aromáticos: Fenilalanina, Triptófano
    • Cíclico: Prolina, (también erróneamente conocida como iminoácido). Los carbonos se unen al nitrógeno del N terminal.
    • Azufre: Metionina
  • Polares
    •  Sin carga
      • Grupos –OH: Serina, Treonina
      • Grupo fenol: Tirosina
      • Tiol –SH: Cisteína
      • Grupo amida: Asparagina, Glutamina
    •  Con carga
      • Ácidos: Ácido aspártico, Ácido glutámico
      • Básicos: Lisina, Arginina, Histidina

Histidina:
Es fundamental para el mantenimiento de la vida celular. El pKa de su grupo imidazol está próximo al pH fisiológico y su mejor capacidad tamponadora ronda ese pH, es por ello que abunda en la hemoglobina.

Interacciones R-R (entre las cadenas laterales)

  1. No covalentes
    1. Van der Waals: por los aminoácidos apolares
    2. Puentes de hidrógeno: carbonilos del Asp, Glu, grupo OH, fenol y amida, incluso también Lys, Arg e His.
    3. Interacciones iónicas: un aminoácido con carga neta positiva establece la interación con uno de carga neta negativa. Interacciones entre aminoácidos ácidos y básicos (Lys + Asp)
  2. Covalentes: son interacciones fuertes
    1. Cadenas laterales de Cys: puentes disulfuro o S-S.
Tema01-cisteina
Lehninger Principles of Biochemistry. Sixth Edition, 2013. Freeman and Company.

Propiedades estereoquímicas:
Todos los proteicos son de configuración L, pero pueden ser dextro o levo debido a que todos, por lo menos tienen un átomo de carbono asimétrico (excepto la Gly).

Propiedades espectroscópicas:
Los tres aminácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp absorben a una longitud de onda λ de 280nm.
En un péptido con 10 aminácidos es posible que no se encuentren residuos aromáticos y la determinación de la concentración en disolución por espectroscopía UV sea más complicada, pero en las proteínas se podría aventurar a decir que todas pueden llegar a tener residuos aromáticos.
Para determinar la concentración de la proteína o péptido en disolución, hay que medir la absorbancia a 280nm, esto nos da unos valores densidad óptica en función con la cantidad de aminácidos aromáticos presentes. A partir de la ecuación de Lambert-Beer, se obtiene la siguiente razón: A = ε·C·l donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción (característico y definido para cada proteína), C es la concentración y l es el paso óptico en cm de la cubeta empleada para hacer la medición.

Reacción con la ninhidrina:
La ninhidrina es un reactivo que da color al interaccionar con los aminácidos. Para que la reacción se lleve a cabo, hacen falta los grupos amino y caboxilo libres.
Esta sustancia que se disuelve en etanol o metanol y cuando reacciona con un aminácido a 100ºC, el aminácido se descarboxila (se libera un CO2), el C-α se oxida; de esta forma se crea una molécula con dobles enlaces conjugados de color violeta. La intensidad del color nos puede dar una idea sobre la concentración de aminácidos presentes durante la prueba.
Hay que recordar que la prolina es un aminoácido cíclico (el grupo amino no es terminal) y es por ello que no reacciona con la ninhidrina.

AMINOÁCIDOS PROTEICOS MODIFICADOS:
Durante el proceso de maduración o modificación de las proteínas, algunos residuos sufren modificación. Es lo que se llama modificación postraduccional.
Algunos ejemplos de ellos son la fosfoserina, donde el grupo –OH de la Ser se ha reemplazado por un fosfato.
Hidroxilisina: un grupo -OH se incorpora en el carbono 3
Hidroxiprolina: en el carbono cíclico, se une un OH.

Continuamos ahora con el tema del enlace peptídico.

REFERENCIAS
D. L. Nelson, M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. 5th edition, 2008. Ed. Freeman.
Voet, Voet. Bioquímica 3rd edition, 2006. Ed. Médica Panamericana.

Enlace: lecciones de Bioquímica.

Bioseguridad y aspectos bioéticos en iPSCs

Nota: aportamos una visión imparcial con este tema, en ningún momento queremos mostrarnos a favor o en contra de lo que se desarrolla en esta entrada. Únicamente exponemos los aspectos que se discuten actualmente citando a los autores respectivos.

John Jairo Aguilera, Raquel Fernández de Llano, Angélica Partida-Hanon, Cristina Parra Sanjosé.

Introducción: La bioseguridad en IPSCs concierne a los riesgos a los que se exponen los trabajadores en el laboratorio y a las normas de seguridad de los diferentes niveles, lo que en inglés se conoce como biosafety. En cambio, biosecurity se entiende como todo aquello que está íntimamente relacionado con evitar las pérdidas del material con el que se trabaja, en el caso de células madre se hace especial hincapié en el control de los procesos de transformación celular para productos destinados a terapia celular.

Biosafety
Los laboratorios están obligados a desarrollar y cumplir un manual de bioseguridad que identifique los riesgos que se pueden encontrar o que se producen, y que explique las medidas que deben tomarse para poder reducir o eliminar las exposiciones a estos riesgos. El personal que allí trabaje debe conocer los riesgos que existen en su laboratorio y está obligado, asimismo, a leer y cumplir las prácticas y procedimientos requeridos. Uno de los términos más importantes es la contención, cuyo objetivo es eliminar o disminuir la exposición del personal científico que trabaja en el laboratorio, otras personas y el medio ambiente externo, a agentes peligrosos.
Dentro de la bioseguridad existen 4 niveles que combinan cada uno, unas técnicas, prácticas, equipos de seguridad e instalaciones determinadas. (CDC, 2009)

Nivel de bioseguridad 1 (BSL – 1)
Este nivel engloba trabajos en los que se utilizan agentes que no producen enfermedades en humanos adultos sanos y que en general, presentan un riesgo mínimo para el personal del laboratorio y el medio ambiente.
No suelen ser necesarios equipos de contención especiales. (CDC, 2009)
I Prácticas estándar: las mínimas de un laboratorio, por ejemplo las que podemos encontrar en un laboratorio de prácticas de una universidad. Existen unas normas de manejo seguro de los materiales tanto biológicos como físico-químicos. Los cultivos, stocks y otros materiales antes de ser desechados se descontaminan, por ejemplo en autoclave.
II Prácticas especiales: no se requiere ninguna.
III Equipos de seguridad: En general no se requieren equipos especiales. Se recomienda el uso uniformes de laboratorio, como la bata, para evitar contaminar la ropa o ensuciarla; guantes en el caso de heridas superficiales o erupciones cutáneas; y gafas en el caso de productos peligrosos que puedan salpicar la zona ocular.
IV Instalaciones: control de acceso mediante puertas, pilas para lavado de manos, superficies impermeables y resistentes a productos químicos y factores físicos como el calor.

Nivel de bioseguridad 2 (BSL – 2)
Similar al anterior, se usa para trabajos con agentes de riesgo moderado para el personal y el medio ambiente.
I Prácticas estándar: las mismas que en el caso anterior.
II Prácticas especiales: la persona encargada del laboratorio puede restringir o limitar el acceso al mismo cuando se estén realizando trabajos con agentes infecciosos (por ejemplo, a personas inmunodeprimidas). Se deben colocar señales de advertencia de riesgo biológicos en la entrada del laboratorio cuando se usen agentes etiológicos. El personal del laboratorio tiene que someterse a las inmunizaciones o análisis de los agentes con los que trabaje (por ejemplo, vacuna contra la hepatitis B). Se limita el uso de objetos punzantes o cortantes contaminados, muchos de ellos suelen ser sustituidos en la medida de lo posible por material de plástico.
III Equipos de seguridad: se usan cabinas de clase II (campanas de flujo laminar por ejemplo) u otros equipos de contención. Protecciones faciales para posibles salpicaduras o aerosoles de materiales infecciosos o peligrosos para el cuerpo. El resto de normas son las mismas que las del nivel 1.
IV Instalaciones: es posible que se requiera una ubicación del laboratorio lejos de áreas públicas. Las cabinas u otros equipos de contención deben instalarse lejos de puertas y ventanas para evitar fluctuaciones en el aire de entrada y escape de la sala.

Nivel de bioseguridad 3 (BSL – 3)
Destinado a trabajos con agentes que pueden producir una enfermedad grave o potencialmente letal a través de vía inhalatoria. Se aplica a instalaciones clínicas, de diagnóstico, investigación o enseñanza. Todos los procedimientos con materiales infecciosos se realizan dentro de cabinas u otros dispositivos de contención.
I Prácticas estándar: las mismas que en los anteriores, pero se puntualiza que los desechos infecciosos se deben descontaminar antes de sacarlos fuera de las instalaciones para desecharlos.
II Prácticas especiales: las mismas que en BSL -2. Toda la manipulación abierta de materiales infecciosos se hace en cabinas de contención.
III Equipos de seguridad: las cabinas de contención que se usan son de clase II o III.
IV Instalaciones: los laboratorios se emplazan alejados de áreas públicas. Sistemas de ventilación por conductos que cree un flujo direccional de aire para eliminar el de las zonas contaminadas.

Nivel de bioseguridad 4 (BSL – 4)
Se aplica para trabajar con agentes peligrosos que producen infecciones transmitidas por aerosoles y enfermedades mortales. También se trabajan en este nivel aquellos agentes que presentan relaciones antigénicas cercanas a los que se trabajan en BSL – 4.

I Prácticas estándar: las mismas que en los anteriores.
II Prácticas especiales: todas las actividades se realizan en las cabinas de clase III o en cabinas de clase II pero con trajes presurizados con presión positiva y de una sola pieza.
III Equipos de seguridad: cabinas de clase III y clase II con uso de trajes especiales.
IV Instalaciones: existen dos tipos, uno de ellos es el laboratorio con cabina, donde todo se realiza en cabinas de clase III; y otro en el que se requiere el uso de trajes especiales. También puede ser una combinación de ambos modelos. (CDC, 2009)

A la hora de trabajar con células y tejidos humanos y de primates se lleva a cabo en laboratorios BSL – 2. A pesar que el riesgo de infección en un laboratorio de células animales es bajo, el riesgo aumenta con el uso de células de primates y en especial de humanos.
Los peligros potenciales asociados al manejo de células y tejidos animales (sobre todo humanas) son el riesgo a exposición a agentes patógenos de la sangre, como VIH, HPV (Virus del papiloma humano), así como Mycobacterium tuberculosis, que puede ser encontrado en células del tejido pulmonar.
Otras células de primates y mamíferos también presentan riesgos, como células inmortalizadas gracias a agentes virales como SV-40.

Todo el trabajo debe realizarse en un gabinete bioseguro y todo el material debe ser descontaminado por medio de autoclave o desinfección antes de ser eliminado. Todos los empleados que trabajan con células y tejidos humanos deben estar inscriptos en el programa institucional de patógenos transmitidos por sangre y deben trabajar conforme a las políticas y guías establecidas por el plan de control de la institución.

Biosecurity
Se entiende biosecurity como todo aquello que está íntimamente relacionado con evitar las pérdidas del material con el que se trabaja, en el caso de células madre se hace especial hincapié en el control de los procesos de transformación celular para productos destinados a terapia celular.

Peligros de contaminación de los cultivos de iPSCs.
Aspectos de bioseguridad a tener en cuenta durante el cultivo de células madre:
1 Contaminación microbiana: Existen peligros de contaminación microbiana en todos los laboratorios, por lo que en el cultivo de iPSCs se usan cabinas de clase II (campanas de flujo laminar por ejemplo) u otros equipos de contención. También se utiliza protección facial para evitar contaminaciones en el cultivo por parte del trabajador.
2 Contaminación celular: La contaminación celular puede venir tanto por parte de células del mismo cultivo en diferentes fases de la manipulación (contaminación de células indiferenciadas con las ya diferenciadas con la consecuente formación de carcinomas) como de otro tipo de células que se cultiven en el mismo laboratorio. Por ellos se utiliza material estéril y los equipos de contención mencionados en el punto previo.
3 Contaminación química:
a Iones metálicos, endotoxinas y otras impurezas del agua o del suero.
b Plastificantes de las botellas de almacenamiento.
c Radicales libres generados por la fotoactivación del triptófano, rivoflavina o HEPES al ser expuestos a luz fluorescente.
d Depósitos de desinfectantes o detergentes en pipetas, instrumentos o recipientes.
e Residuos procedentes de germicidas o pesticidas usados para desinfectar incubadoras, equipamiento o laboratorio.
f Impurezas de gases usados en las incubadoras de CO2.
4 Contaminación xenogénica. (Latil et. al., 2012; García Castro, 2009)

Problemas de bioseguridad que pueden surgir con la aplicación de iPSCs en terapia génica:
1 Formación de tumores: Dependen del potencial tumorigénico. Las células no diferenciadas son tumorigénicas: si se inyectan a un animal adulto originan teratomas y teratocarcinomas. Por lo tanto, un tema de seguridad será asegurarse que en un cultivo diferenciado a partir de iPSCs no quedan estas células indiferenciadas, o bien disponer de métodos fiables de separación y purificación de las células diferenciadas de interés respecto de las iPSCs. Para ello habrá que avanzar en estudios de marcadores (al estilo de los CD de las células inmunes) para caracterizar todas las fases intermedias de cada ruta de diferenciación. Alternativamente, se puede introducir por ingeniería genética en el genoma donante un bloque de genes que permita simultáneamente la selección de las células diferenciadas y un sistema suicida que garantice la autodestrucción de las células que no se hayan diferenciado.
2 Formación de tejidos ectópicos: Otro riesgo del uso de iPSCs en terapia génica es la migración de las células desde los “andamios” y la formación de tejidos ectópicos en otras partes del organismo del paciente.
3 Reacciones inmunológicas: Los problemas actuales ligados a los a los injertos son la escasez de donantes histocompatibles, la necesidad de administrar drogas inmunosupresoras (ciclosporina, corticoides) con sus efectos secundarios (riesgo de infecciones, de cáncer, nefropatías, etc.). Lo ideal sería derivar tejido con la identidad histológica del propio paciente para hacer autotrasplantes, lo que es posible con injertos autólogos. Además en la terapia celular, también son importantes los biomateriales que se usan para implantar las células y tejidos puesto que imitan las funciones de la matriz extracelular de los tejidos, por esta razón tienen que ser compatibles para evitar rechazos o necrosis de los tejidos. Los estudios que se están llevando a cabo no solo buscan desarrollar materiales compatibles, sino que intentan aumentar la eficacia del proceso en su totalidad. Algunos ejemplos se basan en controlar la porosidad del material, otros usan factores físicos y/o químicos; también se emplean enzimas, citoquininas, factores de crecimiento y otras moléculas (Liras, 2010). Para evitar rechazos en la terapia génica se utilizan trasplantes autólogos en la medida de lo posible.
4 Funcionalidad de las células diferenciadas: Un problema de iPSCs es que puede perder la funcionalidad debido a la reindiferenciación de las células o a que su comportamiento in vivo no sea el esperado. Los bancos de células madre juegan un papel clave en la terapia génica. Los bancos conservan líneas celulares, ya sean embrionarias (del cordón umbilical o placenta) o adultas, diferenciadas o no, criocongeladas. La importancia de la conservación radica en que los cultivos de células, sobre todo adultas, deben mantenerse en el cultivo hasta su uso, esto aumenta el riesgo de contaminación o pseudodiferenciación que puede desembocar en una pérdida del material o de funcionalidad (Liras, 2010). De la misma manera para garantizar la bioseguridad en los procedimientos se deben evaluar los procesos de diferenciación ex vivo, tanto in vitro como en animales modelo. En el caso de células embrionarias humanas se deben evaluar más características para su uso clínico, tales como la tasa de crecimiento, formación de teratomas y clonogenicidad. (García-Castro, 2010)

Los protocolos de bioseguridad han de seguirse siempre para prevenir estos problemas y han de hacerse pruebas antes de la utilización en humanos. Las principales causas de contaminación de los cultivos son debidos a contactos con materiales o medios de cultivo no estériles, equivocaciones y errores humanos. Se llevan a cabo cultivos totalmente controlados en lo referente a calidad de la instalación, de los materiales, del aire, de los procedimientos, etc.

Legislación de concierne al cultivo de células madre
El Real decreto 1301/2006 establece las normas de calidad y de seguridad para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos y se aprueban las normas de coordinación y funcionamiento para su uso en humanos.
El trasplante de células y tejidos humanos es un área de la Medicina que ha experimentado un enorme crecimiento en los últimos años y está proporcionando grandes posibilidades terapéuticas para muchos pacientes.
Su creciente utilización clínica requiere la aprobación de una norma que participe de los principios de voluntariedad, anonimato entre donante y receptor, altruismo y solidaridad que caracterizan el modelo de trasplantes del Sistema Nacional de Salud y que recoja los avances técnicos y científicos producidos en esta materia, al tiempo que prevea los sistemas de control de los procesos que se suceden desde la obtención de las células y tejidos hasta su implantación, y las condiciones que deben reunir los centros y unidades de obtención y aplicación y los establecimientos de tejidos. Todo ello con el objetivo de asegurar la calidad y la seguridad de las células y tejidos utilizados que eviten la transmisión de enfermedades y faciliten su utilización terapéutica. (BOE nº270, 2006)

Bioética
Introducción
La bioética es la aplicación de la ética a las ciencias de la salud (DRAE, 2001). La ética es la rama de la filosofía que trata de la moral y de las obligaciones del hombre (DRAE, 2001). La bioética es, por tanto, la pate de la filosofía que se encarga de la moral y de las obligaciones del hombre para consigo mismo en el entorno de las ciencias de la salud, principalmente la medicina y la biología celular, que se suelen englobar en la biomedicina, donde se incluye desde el juramento Hipocrático, hasta el código de Núrenberg, el objetivo final sea obtener soluciones y alternativas sin causar daño, ya que el fin no justifica los medios (Liras, 2010).
En la actualidad, el control ético de la actividad biomédica es un tema socialmente relevante; llegando incluso a causar serios estancamientos producidos fundamentalmente desde el ámbito jurisdiccional a través del rechazo popular que usualmente viene acompañado de desconocimiento y miedo infundado (ceab, 2009).
Desde el descubrimiento de sus potenciales aplicaciones, las células madre embrionarias humanas (hESCs) han tenido que afrontar conflictos éticos promovidos por determinados grupos sociales contrarios a la utilización de embriones humanos y de las hESCs (Montoliu, 2012). La oposición a su aplicación se fundamenta principalmente en creencias socioculturales y filosóficas, tanto ontológicas como éticas.
En esta entrada, se tratarán principalmente los motivos éticos que fundamentan la oposición al uso de las células madre, tanto hESCs como células madre pluripotentes inducidas (iPSCs).

Controversia en torno al uso de hESCs
El debate sobre la ética de las investigaciones con hESCs se ha centrado principalmente en la condición moral de los embriones humanos (Devolver, 2010). Las hESCs se obtienen de dos formas distintas en humanos, principalmente:
● De embriones humanos crioconservados. Las hESCs se obtienen de la disgragación de los embriones. Es, quizás, la técnica más polémica éticamente.
● De óvulos enucleados en los que se introduce un núcleo de blastómeros. Esto implica la existencia una buena regulación de las medidas de protección de los ovocitos donados (Liras, 2010).
Es la primera de las formas de obtención de hESCs la que más suscita controversia ética, ya que para aquellas personas que piensan que los embriones nunca deberían ser sacrificado por y para la investigación científica, puede hacer que la investigación con hESCs sea considerada no ética (Devolder, 2010: Doerflinger, 1999; Moraczewski, 2002).
El mero hecho que sepamos que un embrión es un individuo de nuestra especie nos impulsa a que distingamos en él una dignidad, que le da el rango de congénere y merezca, por ello, un trato equiparable a cualquier hombre. Por esto, la investigación con hESCs da pie a dos grandes afirmaciones en contra de ella:
● El hecho que se investiguen las aplicaciones de las células madre promueve la destrucción de células madre y crea una demanda de las mismas lo que implicará a su vez más destrucción de embriones (Devolder, 2010).
● Éticamente, e implícitamente con lo anterior, se fomenta el irrespeto del embrión (Devolder, 2010), del individuo.
Además, también se debate si realmente es ético la criopreservación de células troncales del cordón umbilical, ya que los biobancos son empresas de carácter privado que únicamente prestan sus servicios a las personas que lo pueden pagar, llegando a ser un filtro discriminatorio (Liras, 2010).

Controversia en torno al uso de las iPSCs
Después de ver la controversia que rodea la investigación de las aplicaciones de las hESCs, se debe mencionar casi en paraposición a ella, las iPSCs. Las iPSCs son células con capacidades muy semejantes a las hESCs, creadas a partir de reprogramación directa por manipulación genética de células somáticas adultas.
Muchos creen que el método de obtención de iPSCs es, tras una larga búsqueda, el método ético de obtención de células pluripotentes (Devolder, 2010). Cuando S. Yamanaka, Premio Nobel en Medicina del 2012, fue galardonado con el premio Shaw de Ciencias de la Salud en el 2008 por el desarrollo de la técnica de obtención de iPSCs, afirmó que uno de los dos grandes temas que se había entablado con el uso de ESCs (y había que solucionar) era la controversia ética que sobre la manipulación de embriones humanos (Yamanaka, 2008), y, por lo que se puede ver, fue unos de los motivos que lo impulsó al desarrollo de esta técnica; que sin requerir la intervención de ningún embrión, alivia con ello la mayoría de problemas éticos que las anteriores aproximaciones experimentales en medicina regenerativa habían suscitado (Montoliu, 2012). Sin embargo, las investigaciones con iPSCs podrían suscitar preocupaciones éticas muy similares a las que rodean a las hESCs (Devolder, 2010).
La forma más eficiente de impulsar el desarrollo y perfeccionar las técnicas de las iPSCs es comparándolas con las técnicas de las hESCs, consideradas todavía como el estándar de oro (Devolder, 2010: Baker, 2009; Daley et al., 2009). Investigaciones recientes resaltan la necesidad de mejorar la potencia de diferenciación de las iPSCs y esto requiere de comparaciones con hESCs (Devolder, 2010: Hu et al., 2010). Esto implica que para hacer comparación es necesario que la investigación con hESCs continúe, es decir, que el trabajo con iPSCs requiere la existencia de investigaciones con hESCs (Devolder, 2010).

Posturas adoptables ante las hESCs y las iPSCs
Parece haber tres opciones o posicionamientos respecto al uso de las hESCs y las iPSCs (Devolder 2010):
1. Rechazar ambas, desechando el enorme potencial de las aplicaciones de ambos tipos de células.
2. Abogar por un cambio en las investigaciones de las iPSCs que no implique la necesidad de líneas de investigación con hESCs. Esta opción imprimiría una lentitud enorme en el desarrollo de las iPSCs.
3. Buscar bases principales del pensamiento que fundamenten de una forma tan irrevocable argumentos en contra del desarrollo de las hESCs, de tal forma que se rechace la investigación para el desarrollo de las iPSCs, por requerir la investigación con las primeras.
4. Rechazar (o, mejor dicho, tolerar) las afirmaciones en contra de las hESCs, dejando un amplio margen para permitir que algunas líneas de investigación de hESCs se lleven a cabo (y por tanto también la investigación iPSC). Esta postura, desde la perspectiva de un biólogo, parece ser la más correcta.

Regulación bioética de la investigación con células madre
La regulación de las investigaciones y usos potenciales que puedan dárseles a las células madre corre a cargo de comités o comisiones de evaluación éticos. Estas comisiones aseguran que las acciones que se lleven a cabo en dichas investigaciones sean lo más éticas y responsables posible; son, por tanto, una serie de entidades que controlan el avance biomédico sin desatender los derechos fundamentales de los seres humanos (ceab, 2009).
El nivel de actuación de estos comités evalúa los métodos, protocolos de investigación y aplicación de la investigación y emiten un dictamen sobre la aceptabilidad de los resultados obtenidos (ceab, 2009).
El mismo propósito albergan las convenciones internacionales que, como el Concilio Europeo en la Convención sobre los Derechos Humanos y Biomedicina, aseguran la protección de la dignidad e identidad de todos los seres humanos y garantizan a todos, sin discriminación, el respeto de su integridad y demás derechos y libertades fundamentales con respecto a las aplicaciones de la biología y la medicina (Capítulo 1, Artículo 1), además de dar a este tipo de investigación un marco ético general y legal para los países signatarios (Liras, 2010).
Es interesante recalcar que hay países a favor son Japón, India, Irán, Israel, Corea del Sur, China y Australia. Nueva Zelanda, gran parte de África (salvo por Sudáfrica) y gran parte de Latinoamérica (excepto por Brasil) tienen restricciones con respecto las investigaciones.
En Estados Unidos la división tiene similitud, teniendo a estados dando un total soporte financiero con otros completamente prohibiéndola.
En la Unión Europea, las investigaciones con hESCs son permitidas en Suecia, Finlandia, Bélgica, Grecia, Gran Bretaña, Dinamarca y Holanda mientras que es ilegal en Alemania, Austria, Irlanda, Italia y Portugal (SCRAW, 2008).

Referencias
BOE nº270 (2006) Real Decreto 1301/2006.
Ceab (2009). Controles Éticos en la actividad biomédica. Instituto Roche.
Centers for Disease Control and Prevention. (2009) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL).
Devolder, K. (2010). Complicity in stem cell research: the case of induced pluripotent stem cells. Human Reproduction 25: 2175–2180.
García-Castro, J (2010) Células madre y bioseguridad. X Semana de la Ciencia
Latil M. et al (2012). Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nature communications: http://www.nature.com/ncomms/journal/v3/n6/full/ncomms1890.html
Liras, A. (2010). Future research and therapeutic applications of human stem cells: general, regulatory, and bioethical aspects. Journal of Translational Medicine, 8:131.
Montoliu, L. (2012). Acércate a nuestros científicos. El Nobel premia la reprogramación celular. SEBBM DIVULGACIÓN.
Stem Cell Research Around the World (SCRAW), Pew Research Center. http://www.pewforum.org/Science-and-Bioethics/Stem-Cell-Research-Around-the-World.aspx
Yamanaka, S. Autobiography. Shaw Prize: http://www.shawprize.org/en/shaw.php?tmp=3&twoid=49&threeid=56&fourid=72&fiveid=16>